毋艷萍

摘 要：根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）全基因組序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，建立了PCV-2全基因組的克隆和序列分析方法，并對(duì)甘肅省兩個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集的疑似PMWS病料進(jìn)行了全基因克隆和序列分析，確定了PCV-2毒株基因序列的變異情況。結(jié)果表明，PCV-2核苷酸序列穩(wěn)定，1株標(biāo)準(zhǔn)株與2株分離株全基因序列均由1 768 bp組成，彼此間序列的同源性達(dá)94.0 %～99.8 % ，2個(gè)分離株之間同源性達(dá)94.2 %～99.8 %；分離株與標(biāo)準(zhǔn)株和Genbank已發(fā)表的23株P(guān)CV-2毒株參考毒株同源性達(dá)92.6 %～100 %。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型；全基因組；序列分析

中圖分類號(hào)：S852 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）05-0050-04

豬圓環(huán)病毒為圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬、單股環(huán)狀無(wú)囊膜的DNA病毒，是已知最小的動(dòng)物病毒之一[1]。根據(jù)其病致性、抗原性及核苷酸序列可分為PCV-1和PCV-2兩個(gè)血清型。PCV-1無(wú)致病性，可以持續(xù)感染PK-15細(xì)胞，但不引起細(xì)胞病變，廣泛存在于正常豬體各器官及豬源細(xì)胞。PCV-2有致病性，與世界各國(guó)發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征密切相關(guān)[2]。該病1991年在加拿大首次報(bào)道，主要感染5～12周齡仔豬，發(fā)病率為20 %～60 %，致死率可達(dá)100 %。臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、黃疸、肝硬變、腹瀉，剖檢可見(jiàn)淋巴組織退化、間質(zhì)性肺炎、肝炎及腎炎等癥狀。除斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以外，豬皮炎與腎炎綜合征、豬繁殖障礙疾病、豬呼吸道疾病綜合征、腸炎等疾病，也被證實(shí)與豬圓環(huán)病毒感染有重要關(guān)聯(lián)。自1996年以來(lái)，該病呈世界性分布，法國(guó)、西班牙、英國(guó)、美國(guó)、北愛(ài)爾蘭等國(guó)家均報(bào)道豬群中存在PMWS。亞洲地區(qū)的日本、韓國(guó)、中國(guó)及臺(tái)灣省也有發(fā)病報(bào)道。PCV-2既可水平傳播，引起斷奶仔豬發(fā)病死亡；亦可垂直傳播，引起母豬繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已引起世界各國(guó)的廣泛重視。

PCV-2基因組全長(zhǎng)為1 767 bp或1 768 bp。PCV-1和PCV-2核苷酸同源性為68 %，其基因組結(jié)構(gòu)相似，PCV-2基因組包含11個(gè)開放閱讀框（ORF1-11），各閱讀框之間大小差異懸殊[2]。其中含有兩個(gè)最大的開放閱讀框：ORF1和ORF2，其中ORF1變異很小，同源性為85 %，主要編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白，ORF2變異較大，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Cap，此蛋白是病毒衣殼蛋白的主要成分，具有較好的抗原性，因此PCV-2Cap蛋白可作為診斷PMWS的特異性抗原[3]。研究還表明PCV-1與PCV-2有一定親緣關(guān)系，但也發(fā)生了較大的變異。

目前PCV-2在國(guó)內(nèi)廣泛流行[4]，了解我國(guó)不同地區(qū)PCV-2毒株間的遺傳差異對(duì)預(yù)防和控制PCV-2的流行具有重要意義。為此對(duì)來(lái)自甘肅省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集的疑似PMWS病料進(jìn)行了全基因克隆和序列分析，確定PCV-2毒株基因序列的變異情況，為甘肅省PCV-2毒株的分子流行病學(xué)及毒株來(lái)源的研究奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

PCV-2毒株標(biāo)準(zhǔn)株、甘肅株，分別命名為BZ株、GS1和GS2株，標(biāo)準(zhǔn)株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心提供的細(xì)胞毒；GS1和GS2株均為組織毒，由甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 試劑

Taq聚合酶和dNTP購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PGEM- T-easy載體試劑盒購(gòu)于華美生物工程公司；感受態(tài)細(xì)菌DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝膠回收試劑盒為美國(guó)Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；LB培養(yǎng)基，英國(guó)產(chǎn)；X-gal和IPTG為Sigma公司產(chǎn)品；其它常用試劑如組織細(xì)胞裂解液、TE、0.5×TBE緩沖液、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基等均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制。

1.1.3 儀器

PCR儀；電泳儀、凝膠成像儀；搖床；低溫高速離心機(jī)；二級(jí)生物安全柜等。

1.2 方法

1.2.1 引物

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV-2核苷酸全序列，自行設(shè)計(jì)兩對(duì)引物A1、A2與B1、B2，此引物分A、B兩段通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出PCV-2的全基因組。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用前溶解于滅菌的ddH2O，濃度為64 pmol/L，-20 ℃保存。

1.2.2 樣品總DNA的提取

根據(jù)資料介紹的方法，取肺織或淋巴結(jié)組200 mg左右置于研磨器中剪碎并研磨，加入2 mL消化液繼續(xù)研磨，取已研磨好的待檢病料上清100 μL，再加入500 μL消化液和蛋白酶K10 μL，混勻，置55 ℃水浴中消化4～16 h以上（隔一定時(shí)間混勻一次）；細(xì)胞培養(yǎng)液提取DNA時(shí)不用蛋白酶K且無(wú)需消化過(guò)夜；取上述處理好的樣品，加入等體積即600 μL的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混合液用力顛倒混勻，12 000 r/min 離心10 min；將上清液500 μL轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的離心管中，加等體積異丙醇混勻，置液氮中1 min，室溫溶化，13 000 r/min 離心15 min；爾后加入1 mL以 75 %冷乙醇13 000 r/min 離心15 min洗滌；棄上清，金屬浴55 ℃15 min溫育晾干乙醇；加入50 μL滅菌水或TE溶解沉淀，作模板保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 全基因片段的PCR擴(kuò)增

20 μL反應(yīng)體系：

在0.5 mLEppendorf管中依次加入以下組分：

1.2.4 A、B段PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

1.2.4.1 PCR產(chǎn)物的回收與純化

參照E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4.2 PCR產(chǎn)物的連接

將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與PGEM- T-easy載體連接。連接反應(yīng)的組成為：

1.2.4.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將1.2.4.2中連接后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。步驟簡(jiǎn)述 如下：

（1）從-70 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴上溶化，取50 μL加入到連接管中，輕輕混勻，冰浴中放置30 min；

（2）將離心管放入42 ℃水浴中熱激30 s，爾后將離心管快速移至冰浴中2 min；

（3）每管加500 μL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置37 ℃，225 r/min搖床上，培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌復(fù)蘇；

（4）每管加入X-gal 10 μL ，IPTG 20 μL，混勻，選擇吸取不同體積（一般取400 μL）菌液涂布于含有50 mg/mL Amp的LB瓊脂板上，倒置平皿于37 ℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4.4 挑菌鑒定

備齊用具，從Amp LB平板上挑取白色中等大小的菌落，接種于4 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min搖床培養(yǎng)2～4 h，供保種測(cè)序之用。

1.2.4.5 PCR鑒定

將目的DNA按1：5用dd H2O稀釋，取2.0 μL作為模板進(jìn)行鑒定，同時(shí)設(shè)不加模板的空白對(duì)照，反應(yīng)體系為：

將以上各組分混勻，瞬時(shí)離心，在核酸擴(kuò)增儀中運(yùn)行以下程序：

95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，末輪循環(huán)后置4 ℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取12 μLPCR產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 A、B段基因序列的測(cè)定

將經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司北京實(shí)驗(yàn)室測(cè)序。每個(gè)插入片段從正反兩個(gè)方向測(cè)通后，驗(yàn)證無(wú)誤，確定為所需基因序列。

1.2.6 A、B段基因序列測(cè)定結(jié)果的分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，獲得PCV-2全基因序列，并將測(cè)定的3株P(guān)CV-2全基因序列和GenBank上已發(fā)表的PCV-2參考毒株進(jìn)行核苷酸同源性分析，繪制相關(guān)遺傳關(guān)系發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 A段PCR擴(kuò)增結(jié)果

A段PCR產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，在790 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.1.2 B段PCR擴(kuò)增結(jié)果

B段PCR產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，在1 012 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

2.2 A、B段基因的克隆鑒定

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別在 990 bp和1 212 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3、圖4）。

2.3 A、B段基因的序列測(cè)定

A段基因核苷酸序列長(zhǎng)度皆為790 bp，B段基因核苷酸序列長(zhǎng)度皆為1 012 bp，用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接后，獲得PCV-2全基因序列長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)株與甘肅株均為1 768 bp。

2.4 PCV-2全基因序列分析

PCV-2各個(gè)分離株之間在進(jìn)化上存在著某些地理位置上的相關(guān)性，分為兩大主支[5-7]。一支以北美洲分離株為主，主要為加拿大和美國(guó)分離株；另外還有日本、韓國(guó)、西班牙、中國(guó)及臺(tái)灣毒株。另一支以歐洲分離株為主，主要為法國(guó)分離株，另外有部分中國(guó)毒株。全基因核苷酸序列比較結(jié)果表明：本研究的2個(gè)分離株之間的全基因核苷酸序列同源性在94.2 % ～99.8 %之間，與23個(gè)PCV2毒株（EU547460 GS12甘肅、EU418627 TangHe河南、DQ915588 GRE、EU136720 PCV2herd D丹麥、EF592576 HLJ1廣東、EF210106 ZheJiang2006、DQ910866 HSH1河北、DQ861902巴西、DQ195679 上海、AY686764 ZJ、AY578327 JS2003 from China、AY556477 HuNan、AY556476 HaiNan、AY556475 GX、AY556474 FJ、AY556473 SD、AY536756 HuZhou0301、AY536755 SX0201、AJ293869英國(guó)、AY321982法國(guó)）進(jìn)行同源性分析，同源性達(dá)92.6 %～100 %。與（AF520783韓國(guó)、DQ397521美國(guó)、AY294310 PCV2-JX中國(guó)）同源性較差。同源性分析表明，所測(cè)定的2個(gè)分離株與歐洲株、法國(guó)株及部分中國(guó)株在同一個(gè)大分枝上；而與韓國(guó)、美國(guó)相對(duì)較遠(yuǎn)。BZ株與AY556473 SD關(guān)系較密切，GS1株、GS2株與EU547460 GS12甘肅關(guān)系較密切（表1、圖5）。雖然并無(wú)證據(jù)表明不同的毒株免疫原性有差異，但在選PCV2疫苗免疫時(shí)，建議盡量使用國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的疫苗進(jìn)行免疫。

3 討論與分析

3.1 引物的設(shè)計(jì)

PCV-2的全基因組有兩種，1 767 bp和1 768 bp，皆為單股環(huán)狀DNA。根據(jù)基因序列比較，二者的差別在于，其序列在1 040 bp處缺失一個(gè)堿基。本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，設(shè)計(jì)了A、B兩對(duì)引物分兩段擴(kuò)增PCV-2全基因序列。A引物對(duì)為UA—816 bp至836 bp，引物長(zhǎng)度21 bp，DA—1 585 bp至1 605 bp，引物長(zhǎng)度20 bp，A對(duì)引物擴(kuò)增從816 bp至1605 bp的基因片段，理論跨度為790 bp；B引物對(duì)為UB—1 591 bp至1 609 bp，引物長(zhǎng)度18 bp，DB—817 bp至835 bp，引物長(zhǎng)度18 bp，B對(duì)引物擴(kuò)增從817 bp至1 591 bp的基因片段，理論跨度為1 012 bp。兩對(duì)引物都避開了堿基缺失部分，這樣在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，不論是1 767 bp還是1 768 bp，均能擴(kuò)增出來(lái)。結(jié)果證實(shí)，本試驗(yàn)建立的方法真實(shí)可靠，擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)株與分離毒株全基因序列均為1 768 bp。

有資料表明設(shè)計(jì)一對(duì)引物從同一點(diǎn)向兩端采用背對(duì)背的方法擴(kuò)增PCV-2的全基因序列。此方法雖然省去了后期進(jìn)行的序列拼接，但由于所擴(kuò)增的目的片段過(guò)長(zhǎng)，試驗(yàn)中需要反復(fù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，PCR過(guò)程中極易出現(xiàn)堿基錯(cuò)配現(xiàn)象，難以保證擴(kuò)增結(jié)果的保真度；同時(shí)也會(huì)造成擴(kuò)增效率的低下。本試驗(yàn)分A、B兩段擴(kuò)增，目的片段為790 bp和1 012 bp，均在有效擴(kuò)增范圍，堿基錯(cuò)配率極低，重復(fù)試驗(yàn)好。況且后期的序列拼接借助DANMAN分析軟件進(jìn)行，不是很繁瑣。實(shí)驗(yàn)的目的是序列的克隆與分析，保證擴(kuò)增的堿基序列與模板序列的一致性才是本試驗(yàn)的重點(diǎn)，試驗(yàn)方法可信，試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可靠。

3.2 序列的比較分析

本試驗(yàn)通過(guò)PCR方法獲得了3株P(guān)CV-2的全基因序列，和GenBank上發(fā)表的PCV-2全基因序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，并繪制遺傳關(guān)系發(fā)育樹。

3.3 分子流行病學(xué)分析

PCV-2的ORF2編碼序列比較分析表明，存在著3個(gè)主要變異區(qū)域（59位～90位，121位～136和190位～210位氨基酸），而其中有2個(gè)（59位～90位和121位～136位氨基酸）與免疫表位（65位～87位和113位～147位氨基酸）相關(guān)，這些表位暴露于免疫壓力下，有可能會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致新的毒株出現(xiàn)，這為疾病的預(yù)防和控制帶來(lái)了更大的難度。

本研究的2個(gè)分離株與1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株，它們與法國(guó)株關(guān)系密切，而法國(guó)是較早發(fā)生PCV-2病的國(guó)家之一，早在1986年可能就有本病的發(fā)生[8-10]。比較的幾個(gè)法國(guó)毒株分離自1995年發(fā)病的豬只。而我國(guó)乃至我省卻是最近幾年才有PCV-2病的發(fā)生，這可能是由于前些年從歐洲引進(jìn)豬種，而所引進(jìn)豬種體內(nèi)本來(lái)就存在PCV-2所致。推測(cè)當(dāng)時(shí)（20世紀(jì)80年代末90年代初）由于養(yǎng)殖業(yè)剛剛起步，飼養(yǎng)規(guī)模小、飼養(yǎng)環(huán)境較好污染不嚴(yán)重、疾病種類不多，疫苗接種還不頻繁，病毒缺乏共刺激等因素，不能導(dǎo)致疾病發(fā)生[9]。但病毒在豬體內(nèi)長(zhǎng)期存在，并與宿主共同演化，演化的結(jié)果產(chǎn)生了微小的變異。近十年來(lái)隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，新病不斷出現(xiàn)，尤其是豬繁殖與呼吸綜合征最近幾年的暴發(fā)與流行。加之疫苗接種的日齡不斷提前、疫苗種類的不斷增多。這些因素可能上調(diào)了PCV-2在體內(nèi)的復(fù)制，導(dǎo)致了疾病的發(fā)生[11-13]。

3.4 PCV-2感染能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、豬繁殖障礙，吸吸道疾病等，且常和PRRSV、PPV、PRV等病毒混合感染造成更大的經(jīng)濟(jì)損失，因此研制PCV-2的診斷試劑和疫苗是當(dāng)務(wù)之急。本試驗(yàn)結(jié)果明確了目前甘肅省PCV-2流行毒株基因組的分子學(xué)特征，毒株間親緣關(guān)系密切，變異度不大?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（13篇，略）