魏暉　張東軍

摘要：以MRS和Elliker培養(yǎng)基，對采自新疆傳統(tǒng)奶疙瘩中的乳酸菌進行分離，首先將樣品進行富集培養(yǎng)，對樣品進行活化。再通過涂布平板法和劃線分離法初步篩選。對平板菌落參考常規(guī)乳酸菌分離鑒定方法進行初步鑒定，然后對初步分離到的細菌進行劃線分離純化，得到的純種菌落進行革蘭氏染色、鏡檢、H2O2酶試驗，將革蘭氏陽性、無芽孢、H2O2酶陰性的菌株暫定為乳酸菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化試驗，得到初步定為乳酸菌的菌株3株。

關(guān)鍵詞：奶疙瘩 乳酸菌 分離

中圖分類號：TS252.1 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）08-0040-04

乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱，自然界廣泛存在，用乳酸菌發(fā)酵食品不產(chǎn)生任何毒素或毒性物質(zhì)，而且乳酸菌還具有改善和平衡腸道、增強胃腸功能的作用，在增進人們體質(zhì)與健康方面能達到食療兼收的效果。全國各地均有不同形式的乳酸菌發(fā)酵食品在市場銷售或民間流傳，新疆有當?shù)鬲毺氐娜樗峋l(fā)酵乳制品：酸奶疙瘩、酸奶干等十余種產(chǎn)品，營養(yǎng)豐富、老幼皆宜。

無論對哪種乳酸菌發(fā)酵食品來說，所用乳酸菌的數(shù)量、形態(tài)、特異性能等對產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣都起著重要的作用。本研究從新疆牧區(qū)酸奶粒中分離純化出具有典型乳酸菌菌落形態(tài)的菌株，用MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基及其對應(yīng)CaCO3改良培養(yǎng)基進行分離，然后進行生理生化鑒定，從而篩選純化出優(yōu)良菌株。

本研究主要針對新疆牧區(qū)的乳制品進行乳酸菌的分離鑒定，并進行產(chǎn)酸特性的研究，旨在了解新疆傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的種類，并了解其產(chǎn)酸情況以豐富我國的乳酸菌資源。

1 實驗材料

1.1 菌種

醋酸菌、啤酒酵母菌：來自河南工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實驗室。

1.2 原料

酸奶疙瘩來自新疆牧區(qū)；脫脂牛奶，購買于丹尼斯超市；馬鈴薯，購買于農(nóng)貿(mào)市場；鮮牛奶，購買于奶牛場。

1.3 主要儀器（如表1）

1.4 主要試劑（如表2）

1.5 培養(yǎng)基及試劑

1.5.1 試劑

3%過氧化氫溶液；明膠；硝酸；革蘭氏劑。

1.5.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（半選擇性培養(yǎng)基）：調(diào)pH至6.2～6.4，121℃濕熱滅菌20min，桿菌是區(qū)系中主要菌時，常用MRS瓊脂作分離用培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基主要用于乳酸桿菌和其他乳酸菌。

PY培養(yǎng)基：將各種材料混合溶解于300mL蒸餾水中，再加500mL水，一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類。繼續(xù)攪拌直到全部溶解，加200mL蒸餾水，混合后貯備于4℃。

PYG培養(yǎng)基：在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)加入1.0g葡萄糖即成為PYG培養(yǎng)基。

2 實驗方法

2.1 乳酸菌的分離

2.1.1 樣品采集與處理

試驗前，將樣品的表面先用無菌生理鹽水清洗，再切碎、研磨，然后以1：9（g/mL）的比例置于MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃厭氧培養(yǎng)24～72h。

2.1.2 乳酸菌的分離方法

第一、將富集活化樣品用無菌生理鹽水分別稀釋到10-2、10-3、10-4三個稀釋度。

第二、分別吸取1mL樣品于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)皿內(nèi).將10-1、10-2、10-3、10-4每個稀釋度分別劃線和涂布一次。置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h。

第三、觀察菌落的形態(tài)，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及周圍培養(yǎng)基亦為黃色者初步定為目標菌株，挑取單個可疑菌落，反復(fù)劃線，直至獲得純的菌株。

第四、將分離純化得到的菌株進行革蘭氏染色、鏡鑒。

2.2 生理生化鑒定

2.2.1 葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗

（1）培養(yǎng)基：在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入30g葡萄糖和 0.5mL的吐溫80，再添加6g瓊脂做成軟瓊脂柱。分裝試管，高度4-5cm。為便于觀察產(chǎn)酸情況，可在培養(yǎng)基內(nèi)加入濃度為1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL指示劑，置于112℃滅菌20min。

（2）接種和培養(yǎng)：用較大量的新鮮活力強的菌種進行穿刺接種，然后在上加蓋一層約7mm厚的2%瓊脂，置于37℃培養(yǎng)。

（3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)基中指示劑變黃表示產(chǎn)酸；軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或出現(xiàn)將2%瓊脂層向上頂?shù)默F(xiàn)象，表示產(chǎn)氣。

2.2.2 淀粉水解實驗

（1）培養(yǎng)基：在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中加入0.5g可溶性淀粉，分裝試管，112℃滅菌30min。（2）接種和培養(yǎng)：接種新鮮活躍菌種，37℃培養(yǎng)2d。（3）結(jié)果與檢測：向試管中加入盧哥氏碘液，觀察試管中培養(yǎng)液顏色變化，接種試管不顯色表示淀粉水解，顯藍黑色或藍紫色時，表示淀粉未水解或水解不完全。

2.2.3 甲基紅實驗

（1）培養(yǎng)基：PYG培養(yǎng)基，分裝三角瓶，（2）接種和培養(yǎng)：將新鮮活躍菌種接種于試管，用一個三角瓶作對照37℃培養(yǎng)2d。（3）結(jié)果與檢測：向三角瓶中加入幾滴甲基紅酒精溶液，如果變紅，則為陽性。

2.2.4 乙酰甲基甲醇試驗

（1）培養(yǎng)基：PYG培養(yǎng)基，分裝三角瓶。

（2）接種和培養(yǎng)：將新鮮活躍菌種接種于試管，用一個三角瓶作對照，37℃培養(yǎng)2d。

（3）結(jié)果與檢測：取1mL培養(yǎng)液，加入1mL10%的NaOH混勻，再加入3～4滴氯化鐵，數(shù)小時后，培養(yǎng)基表面下層出現(xiàn)紅色者，為陽性。

2.2.5 石蕊牛奶實驗

（1）培養(yǎng)基：每100mL脫脂牛奶加4mL濃度為25g/L的石蕊牛奶分裝試管。牛奶高度4～5cm 113℃滅菌15-20min。（2）接種和培養(yǎng)：接種新鮮活躍菌種，37℃培養(yǎng)2d。（3）結(jié)果與檢測：37℃培養(yǎng)1～3d即可觀察石蕊牛奶產(chǎn)酸和凝固反應(yīng)。

2.2.6 硫化氫的產(chǎn)生

（1）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g；牛肉膏3g；酵母提取物5g；NaCl 5g；半胱氨酸0.4g；葡萄糖2g；蒸餾水1L。調(diào)pH至7.2～7.4經(jīng)113℃滅菌20min。

（2）乙酸鉛試紙條的制備：將普通濾紙剪成約0.5～0.6cm的寬紙條，長度根據(jù)試管和培養(yǎng)基高度而定。用濃度為50～100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘箱里烘干，放入試管內(nèi)，滅菌后備用。

（3）接種和結(jié)果觀察：將新鮮培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)液后，用無菌的鑷子夾取一乙酸鉛紙條懸掛于接種管內(nèi)。下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。試驗中設(shè)空白對照，在未接種的試管培養(yǎng)基上懸掛乙酸鉛紙條。另外接種已知菌的陰性反應(yīng)做對照。置于37℃培養(yǎng)，進行觀察比較，紙條變黑為陽性反應(yīng)。

2.2.7 明膠液化實驗

（1）培養(yǎng)基：蛋白胨1g；酵母提取物1g；葡萄糖0.1g；鹽溶液4.0mL；H2O100mL。調(diào)pH至7.0，分裝試管加明膠0.6g/管，加煮沸液5mL/管，113～115℃ 15～20min。（2）接種和培養(yǎng)：接種后置于37℃培養(yǎng)3d，培養(yǎng)時有兩只未接種的試管作對照。（3）結(jié)果觀察：從培養(yǎng)箱里取出試管，低溫處理，待對照管凝固，記錄結(jié)果，如果對照管凝固時，接種管液化為陽性反應(yīng)，同時凝固或液化為陰性結(jié)果。

2.2.8 紙層析

（1）展開劑：水：苯甲醇：正丁醇按體積比1：5：5的量混合，然后加1%的甲酸。（2）顯色劑：0.04%溴酚藍酒精溶液，用0.1mol/LNaCl調(diào)pH6.7。（3）結(jié)果與觀察：展析上行25cm后，取出晾干后噴顯色劑，觀察樣品上是否出現(xiàn)黃色斑點，并與對照比較，以2%的乳酸為對照。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離和純化

從新疆酸奶疙瘩中通過MRS平板分離純化出三株疑似乳酸菌，分別為乳酸長桿菌、乳酸短桿菌和乳酸鏈球菌。進一步進行是否產(chǎn)乳酸測定、革蘭氏染色以及生理生化鑒定。

3.2 乳酸菌的鑒定

3.2.1 細胞形態(tài)及菌落特征

根據(jù)圖3-1、表1和表2，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《一般細菌常用鑒定方法》可知，Lacto-A、Lacto-B為乳桿菌，Lacto-C為乳鏈球菌。

3.2.2 菌株生理生化鑒定

3.2.2.1 葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗

通過用較大量的新鮮活力強的菌種對葡萄糖培養(yǎng)基進行穿刺接種，然后在上加蓋一層約7mm厚的2%瓊脂，于37℃培養(yǎng)。結(jié)果見圖3-2培養(yǎng)基中指示劑變黃而對照組顏色不變，說明分離的菌株產(chǎn)酸；圖3-3軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，說明分離菌株產(chǎn)氣。

3.2.2.2 淀粉水解實驗

在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉，接種新鮮活躍菌種，37℃培養(yǎng)2d。然后向試管中加入盧哥氏碘液，觀察接種管與對照組試管中培養(yǎng)液的顏色變化，結(jié)果見圖3-4接種試管不顯色說明分離菌株水解淀粉，對照組顯藍黑色說明淀粉沒有被水解。

3.2.2.3 甲基紅實驗

通過將PYG培養(yǎng)液，分裝三角瓶，將新鮮活躍菌種接種于三角瓶，用一個三角瓶作對照37℃培養(yǎng)2d。向三角瓶中加入幾滴甲基紅酒精溶液，結(jié)果見圖3-5接種組的三角瓶中培養(yǎng)液變紅，說明分離菌呈陽性。

3.2.2.4 乙酰甲基甲醇試驗

通過取1mL培養(yǎng)液，加入1mL10%的NaOH混勻，再加入3-4滴氯化鐵，數(shù)小時后，結(jié)果見圖3-6培養(yǎng)液表面下層出現(xiàn)紅色，說明分離菌株為陽性。

3.2.2.5 石蕊牛奶實驗

通過向石蕊牛奶分裝試管中接種新鮮活躍菌種，37℃培養(yǎng)1～3d，結(jié)果見圖3-7觀察接種組石蕊牛奶顏色變?yōu)榉奂t色并發(fā)生凝固反應(yīng)，對照組沒有變化，說明分離菌產(chǎn)酸。

3.2.2.6 硫化氫的產(chǎn)生

將浸透濃度為50～100g/L的乙酸鉛并烘干的約 0.5～0.6cm寬的濾紙條，用無菌的鑷子夾取懸掛于接種管內(nèi)。下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。試驗中設(shè)有的空白對照，在未接種的試管培養(yǎng)基上懸掛乙酸鉛紙條。置于37℃培養(yǎng)，結(jié)果見圖3-8接種管的紙條變黑，說明分離菌產(chǎn)H2S氣體，將乙酸鉛中的鉛離子還原為鉛，即濾紙顯黑色，說明分離菌為陰性反應(yīng)。

3.2.2.7 明膠液化實驗

從培養(yǎng)箱里取出試管，將對照組和接種管低溫處理，待對照管凝固，結(jié)果見圖3-9對照管和接種管同時凝固，說明分離菌顯陰性。

3.2.2.8 紙層析

發(fā)酵液中乳酸菌生成大量的乳酸，發(fā)酵液中加入5%的碳酸鈣，攪拌后，緩緩加入H2SO4到pH值為2.0，高速離心機5000rpm，離心10min，然后取上清，經(jīng)真空回旋蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10體積，與2%的乳酸作對照，與樣品平行點樣層析。結(jié)果，噴0.04%的溴甲酚藍酒精溶液后，樣品上是否出現(xiàn)黃色斑點，發(fā)酵液斑點與2%乳酸對照組上升同等高度（見圖3-10），說明，分離菌產(chǎn)乳酸，即分離菌為乳酸菌。

4 結(jié)論

（1）富集培養(yǎng)的MRS平板長有較多的乳酸菌，并且不易染菌，直接劃線法做的MRS平板沒有長出乳酸菌。由此，酸奶疙瘩在分離乳酸菌之前要進行活化。 （2）經(jīng)過各種鑒定得出，所分離出的菌為乳酸菌，經(jīng)鏡檢為乳酸桿菌、乳酸球菌。

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