韓欣等

摘 要：從沾化百草枯污染土壤中富集、篩選、分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，進一步研究了這3株優(yōu)勢菌的生理生化特征及最佳生長條件。通過形態(tài)學觀察和生理生化指標的測定，對這3株菌種進行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)這3株菌株（BCK-1，BCK-2，BCK-3）對百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%和86.22%。3株優(yōu)勢菌種可應用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復。

關(guān)鍵詞：百草枯降解菌；分離；鑒定

中圖分類號 S48 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-38-03

Abstract：Three strains were isolated from the Zhanhua paraquat contaminated soil，and optimal growth conditions were further studied on the physiological and biochemical characteristics of the three dominant bacteria. The Determination by morphological observation，physiological and biochemical indicators were identified，these three strains are initially identified BCK-1 Oscillosporia Chatton&Perard，BCK-2 for Clostridium Prazmowski，BCK-3 Sporohalobacter Orenetal. These three strains at 37℃ after 3d found three strains （BCK-1，BCK-2，BCK-3）and the degradation rate of paraquat were 79.35%，80.26% and 86.22%，respectively. The three dominant strain can be applied to paraquat contaminated bacteria source soil biological recovery.

Key words：Paraquat degrading bacteria；Separate；Appraisal

百草枯是一種被廣泛使用的人工合成有機農(nóng)藥，具有殺草活性高、選擇性強、用量少等優(yōu)點，已成為濱州地區(qū)用量最大的除草劑之一。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用的同時，百草枯也不可避免的在土壤中殘留[1]，從而抑制土壤中微生物的生長，降低土壤的肥力，以及對非靶標的陸上或水生生物產(chǎn)生危害，最終影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人們的身體健康[2]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應用微生物降解農(nóng)藥殘留具有安全性好、效果好、費用低、處理徹底、無二次污染等優(yōu)點。利用微生物降解百草枯及修復被污染的土壤[3]，將具有十分廣泛的應用前景[4]。目前，國外所報告的對百草枯有降解作用的微生物主要有放線菌、真菌、細菌等，我國關(guān)于百草枯降解菌的報道較少，其中在《百草枯降解菌研究初報》中，延安大學高小朋、王海虹、陳彥羽從長期噴施百草枯的土壤中經(jīng)富集、篩選[5]，得到4株百草枯降解菌。

本研究從濱州沾化百草枯污染的土壤中富集、篩選、分離出3株降解菌株，并且通過形態(tài)學觀察和生理生化特征的測定對其進行了初步鑒定，同時進一步研究了它們的最佳生長條件和降解特性。

1 材料與方法

1.1 供試材料 菌株來源：濱州沾化百草枯污染土壤；培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、以百草枯為唯一碳源的培養(yǎng)基、全營養(yǎng)培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌源的富集 從長期使用百草枯的農(nóng)田中取土樣，富集培養(yǎng)。

1.2.2 百草枯降解菌株的分離[6] （1）制備菌懸稀釋液：稀釋度到10-5稀釋液，待用。（2）分離單菌株：將稀釋后的稀釋菌液分別涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48～72h。隨后在以百草枯為唯一碳源培養(yǎng)基上劃線分離。培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于斜面保藏在4℃冰箱中。

1.2.3 菌株降解百草枯 挑取平板上的單菌落按4%的接種量接入以百草枯為唯一碳源的液體培養(yǎng)基[7]，28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)2d。在相同的培養(yǎng)條件下，設(shè)置不接種的以百草枯為唯一碳源的液體培養(yǎng)基作對照。

1.2.4 選出優(yōu)勢菌種并測定降解率 以稀釋涂平板法、分光光度計法進行優(yōu)勢菌種培養(yǎng)和降解率的測定。百草枯降解率的計算[8]：百草枯降解率（%）=[（對照濃度-樣品濃度）/對照濃度]×100。

1.2.5 優(yōu)勢菌種菌落的形態(tài)觀察 用放大鏡進行觀察菌落形狀、大小、顏色、光澤度、粘稠度、邊緣、隆起狀態(tài)、透明度等。

1.2.6 優(yōu)勢菌種生理特征的測定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]分別從革蘭氏染色，運動性測定，芽孢，光鏡下觀察個體形態(tài)、生長溫度及耐受性這5個方面進行了測定。

1.2.7 優(yōu)勢菌種生化特征測定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]分別從糖發(fā)酵實驗，甲基紅（M.R）實驗，V-P實驗，吲哚實驗這4個方面進行了測定。

1.2.8 優(yōu)勢菌種最適生長條件的測定 （1）測定生長量[11]：用可見光分光光度法測定各溫度下菌液的OD值（600nm），確定生長量。（2）測定最適pH、最適溫度、最適NaCl濃度、最適百草枯濃度[12]。

1.2.9 菌體生長曲線的測定 按沈萍等[13]方法進行菌體生長曲線的測定。endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢菌種最適生長條件 由圖1中各個曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進一步研究了這3株優(yōu)勢菌的生理生化特征及最佳生長條件。通過形態(tài)學觀察和生理生化指標的測定，對這3株菌種進行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實驗室條件下對百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%。可能由于這3株優(yōu)勢降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢菌種可應用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復。

參考文獻

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[13]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2001.

[14]Cheng HR，Jiang N.Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J].Biotechnology Letters，2006，28：55-59.

[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

（責編：張宏民）endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢菌種最適生長條件 由圖1中各個曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進一步研究了這3株優(yōu)勢菌的生理生化特征及最佳生長條件。通過形態(tài)學觀察和生理生化指標的測定，對這3株菌種進行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實驗室條件下對百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%?？赡苡捎谶@3株優(yōu)勢降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢菌種可應用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復。

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[14]Cheng HR，Jiang N.Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J].Biotechnology Letters，2006，28：55-59.

[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

（責編：張宏民）endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢菌種最適生長條件 由圖1中各個曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進一步研究了這3株優(yōu)勢菌的生理生化特征及最佳生長條件。通過形態(tài)學觀察和生理生化指標的測定，對這3株菌種進行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實驗室條件下對百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%?？赡苡捎谶@3株優(yōu)勢降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢菌種可應用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復。

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[9]東秀珠，蔡妙英，等.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.2.

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（責編：張宏民）endprint