陳淑華，庫旭鋼，閆貴偉，丁振江，何啟蓋＊

（1.農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070）

豬A群輪狀病毒VP6的表達及IgG抗體ELISA檢測方法的建立與初步應用

陳淑華1，2，庫旭鋼1，2，閆貴偉1，2，丁振江1，2，何啟蓋1，2＊

（1.農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070）

為建立豬A群輪狀病毒抗體間接ELISA檢測方法，用于開展對該病毒感染的流行病學調(diào)查和免疫抗體評估，進行了豬A群輪狀病毒TM-a株內(nèi)衣殼VP6基因的表達，用SDS-PAGE和Western blot鑒定分析。目的蛋白得到表達，大小約70ku，Western blot表明，該蛋白與豬A群輪狀病毒陽性血清反應。用該蛋白作為包被抗原，通過對條件優(yōu)化，包被抗原濃度為2μg／mL，待檢血清稀釋倍數(shù)為1∶40倍，標記抗體的稀釋倍數(shù)為1∶4 000倍，建立了檢測豬輪狀病毒血清IgG抗體的間接ELISA方法。用該方法檢測臨床樣品142份，并與間接免疫熒光試驗（IFA）對比，結(jié)果顯示，兩者陽性符合率為94.6%，陰性符合率為83.4%，總符合率為91.5%，表明該方法有效可行。用建立的方法檢測臨床上不同年齡階段的豬血清639份，分析其臨床感染情況。結(jié)果證明該方法可用于豬輪狀病毒流行病學調(diào)查、豬群抗體水平評估。

豬輪狀病毒；內(nèi)衣殼蛋白；間接ELISA

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬呼腸病毒科輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒和幼齡動物腹瀉的一種病原［1］，感染豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）的仔豬以厭食、嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床特征，嚴重的排水樣糞便，導致仔豬死亡［2］。在全國發(fā)生大規(guī)模的仔豬病毒性腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，豬輪狀病毒也是引起仔豬腹瀉的重要病原之一［3］。

輪狀病毒基因組由11個dsRNA片段組成，分別編碼病毒6個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP），結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定［4］。VP6蛋白是重要的群抗原，屬于內(nèi)層衣殼蛋白，占病毒蛋白總量的51%，能夠產(chǎn)生特異性抗原決定簇，而且在病毒的復制和裝配過程中發(fā)揮重要的作用［5－8］。RV根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)和抗原性分為A～G等7個組。A組、B組和C組可引起人類和動物感染，而D組、E組、F組和G組主要引起動物感染。其中A組RV在人類和動物中感染最為普遍［9］。因此，本研究利用豬A群輪狀病毒的群抗原VP6蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬A群輪狀病毒抗體的間接ELISA檢測方法，為豬A群輪狀病毒的流行病學調(diào)查奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細胞、血清 豬A群輪狀病毒TM-a株由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室分離保存；細胞MA-104由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供；豬輪狀病毒（PoRV）陽性血清、豬輪狀病毒（PoRV）陰性血清、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽性血清、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性血清、豬偽狂犬病病毒（PRV）陽性血清，由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室保存或制備。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；載體pGEX-KG，由本實驗室保存；脫脂奶粉為BD公司產(chǎn)品；BSA為AMRESCO公司產(chǎn)品；Tween-20為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗豬IgG為AbDSerotec公司產(chǎn)品；TMB底物顯色液為3，3，5，5、四甲基聯(lián)苯氨、6孔酶標板為Costar公司產(chǎn)品；Theromo-MK 3型酶標儀為賽默飛世爾（上海）有限公司產(chǎn)品；其他化學試劑為分析純。

1.1.3 菌株 大腸埃希菌JM105菌株，由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬輪狀病毒陽性和陰性血清的制備 選用45日齡的保育豬6頭，分成2組，每組各3頭，1組攻毒、1組對照。毒株為豬A群輪狀病毒TM-a株，此毒株病毒滴度為108.5TCID50／mL。用該毒株攻毒，45日齡首次攻毒，攻毒劑量為5mL每頭；75日齡先采血再攻毒，攻毒劑量為5mL每頭，105日齡采血。對照不攻毒，同樣時間段采血，其血清為陰性血清。

1.2.2 檢測豬輪狀病毒的間接免疫熒光試驗 間接免疫熒光試驗操作步驟：取長滿的MA-104細胞1瓶，將細胞吹散，細胞懸液200μL／孔加入96孔細胞板中，在體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)；待細胞長成單層后，接毒（豬A群輪狀病毒TM-a株）100μL／孔，37℃培養(yǎng)1h后，再加入MEM細胞維持液100μL／孔，同時設不接毒的空白對照組；在細胞發(fā)生病變之前，棄去96孔細胞培養(yǎng)板中的 MEM 維持液，用PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干；加入－20℃冷丙酮，100μL／孔，放入－20℃冰箱，固定30min；用PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干，將96孔板自然晾干；加入1∶40倍稀釋的陽性和陰性血清各100μL，37 ℃培養(yǎng)30min；用 PBS洗滌，200μL／孔，每次3min，洗滌5次，拍干，加入1∶60倍稀釋的羊抗豬FITC標記的熒光二抗50μL，37℃培養(yǎng)30min；用PBS洗滌，200μL，每次3min，洗滌5次，拍干；在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 重組菌的構(gòu)建 將PoRV TM-a株接種MA-104細胞，待出現(xiàn)病變后，反復凍融細胞3次，離心取上清液，用于提取病毒總 RNA［10］，RT-PCR擴增輪狀病毒的VP6全基因，構(gòu)建重組菌。引物為VP6F：CCGAATTCATGGAGGTTCTGTACTCATT，VP6R：CCCGTCGACTCACTTAATCAA-CATGCTTC，其中VP6F帶有EcoRⅠ酶切位點，VP6R帶有SalⅠ酶切位點（下劃線為相應酶切位點）。擴增條件為：94℃5min；94℃50min，56℃1min，72 ℃ 1min，35個循環(huán)；72 ℃ 10min，4 ℃5min。回收PCR產(chǎn)物，將PCR回收產(chǎn)物和pGEXKG載體分別用EcoRⅠ＋SalⅠ雙酶切后連接轉(zhuǎn)化于大腸埃希菌JM105感受態(tài)細胞中，經(jīng)測序鑒定正確后用于VP6蛋白的誘導表達。

1.2.4 VP6蛋白的誘導表達及鑒定 重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基復蘇，37℃培養(yǎng)過夜后，按1∶100接種于含有10μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，放37℃搖床中培養(yǎng)至OD 630nm值約為0.5時，加IPTG至終濃度為1mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)6h，每隔1h取1.5mL菌液進行SDS-PAGE制樣。將菌液于4℃、8 000r／min離心5min，沉淀用50μL滅菌水重懸，煮沸10min，冰浴10min后，于4℃、8000r／min離心5min，取上清與等量2XLoading buffer混勻后水浴煮沸10min，用于SDS-PAGE電泳分析。

重組菌經(jīng)放大體系IPTG誘導后，在蛋白最大表達量時收集菌液，用buffer A重懸，反復凍融3次，超聲波破碎后于4℃、12 000r／min離心10min，沉淀用SDS-PAGE檢測，將提取的包涵體用含GST標簽的層析柱純化。純化后進行 Western blot鑒定。蛋白濃度用蛋白儀器測定。

1.2.5 間接ELISA方法的建立

1.2.5.1 蛋白包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定利用方陣滴定原理［11］，將蛋白依次稀釋成10、8、6、4、2、1、0.5、0.25μg／mL，陽性和陰性血清依次稀釋成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640，計算對應的P／N值，P／N值最大的為蛋白包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.2.5.2 包被條件的確定 以確定的最佳蛋白包被濃度進行包被，分別于37℃孵育1h后4℃過夜，37℃孵育2h，依次封閉、一抗反應、二抗反應、顯色、終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，P／N值最大的為包被條件。

1.2.5.3 封閉液和封閉時間的確定 以確定的最佳蛋白包被濃度、包被條件進行包被，用5種不同封閉液（5g／L BSA，50g／L脫脂奶粉，4g／L的明膠，20g／L的海藻糖，20g／L的PEG8000）依次進行封閉、一抗反應、二抗反應、顯色、終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，以P／N值最大的組確定封閉液。將選擇的封閉液分別在37℃封閉1、1.5、2、2.5、3h，隨后一抗反應、二抗反應、顯色、終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，以P／N值最大的組確定封閉時間。

1.2.5.4 待檢血清反應時間的確定 在已優(yōu)化反應條件的基礎上，按反應時間分成5組，分別為37℃孵育30、45、60、90、120min，經(jīng)洗滌、顯示、終止反應，用測得的OD值630nm計算P／N值，以P／N值最大的組確定一抗即待檢血清反應時間。

1.2.5.5 標記抗體工作濃度和反應時間的確定在已優(yōu)化反應條件的基礎上，根據(jù)二抗使用說明書，按二抗?jié)舛炔煌殖?組，分別為1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。經(jīng)洗滌、顯色、終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，以P／N值最大的組確定二抗工作濃度。已優(yōu)化反應條件的基礎上，將二抗分別在37℃孵育15、30、45、60min這4個不同時間段反應。經(jīng)洗滌、顯色、終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，以P／N值最大的組確定二抗工作時間。

1.2.5.6 底物反應時間的確定 在已經(jīng)優(yōu)化的反應條件的基礎上，按底物的作用時間分成4組，37℃作用5、10、15、20min，終止反應，用測得的OD 630nm值計算P／N值，以P／N值最大的組確定底物反應時間。

1.2.5.7 判定標準的確定 選擇20份經(jīng)間接免疫熒光試驗確定為陰性的血清，根據(jù)統(tǒng)計學原理，當樣本OD 630nm值≥X＋3SD時，可以在99.9%的水平上判定為抗體陽性，當樣品OD 630nm值＜X＋3SD時，可以在99.9%的水平上判定為抗體陰性。

1.2.6 特異性試驗 在相同的條件下對PEDV，TGEV、CSFV、PRV、PRRSV陽性血清進行檢測，同時設PoRV的陽性和陰性對照和空白孔對照，評價ELISA 的特異性［12］。

1.2.7 敏感性試驗 對標準陽性血清進行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 084 倍 稀 釋［13］，分 別 用 建 立 的ELISA方法和間接免疫熒光試驗檢測，對試驗結(jié)果進行對比，評價ELISA的敏感性。

1.2.8 與間接免疫熒光試驗方法的比較 隨機抽取142份血清，分別用建立的ELISA方法和間接免疫熒光試驗檢測，對試驗結(jié)果進行對比。

1.2.9 臨床初步應用檢測 用建立的ELISA方法對來自湖北、河北、江西、四川、福建等省份的臨床樣品639份進行檢測，對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 獲得豬輪狀病毒陽性和陰性血清

制備的豬輪狀病毒陽性血清（第2次采血的血清）用間接免疫熒光試驗檢測，出現(xiàn)強陽性信號，獲得豬輪狀病毒陽性血清（圖1）；制備的豬輪狀病毒陰性血清（第2次采血）用間接免疫熒光試驗檢測，無陽性信號，獲得豬輪狀病毒陰性血清（圖2）。

圖1 豬輪狀病毒陽性血清間接免疫熒光試驗Fig.1 Results of porcine rotavirus positive serum detected by IFA

圖2 豬輪狀病毒陰性血清間接免疫熒光試驗Fig.2 Results of porcine rotavirus negative serum detected by IFA

2.2 VP6基因的擴增

反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增豬輪狀病毒TM-a株VP6基因結(jié)果見圖3。

2.3 重組質(zhì)粒pGEX-KG-VP6的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ＋SalⅠ雙酶切得到2條大小分別為1 194bp和5 006bp的片段，分別為插入的VP6基因和載體質(zhì)粒（圖4）。

2.4 SDS-PAGE分析

試驗結(jié)果顯示，重組菌經(jīng)IPTG誘導后，在約70ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶。經(jīng)不同時間誘導表達，誘導4h時蛋白表達量最大，對照質(zhì)粒在相應的條帶處無表達（圖5）。

圖3 VP6基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of VP6gene products amplified by PCR

圖4 重組表達質(zhì)粒pGEX-KG-VP6的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion identification of pGEX-KG-VP6

圖5 重組菌pGEX-KG-VP6不同時間誘導表達的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expressed proteins from the induced pGEX-KG-VP6 in different time

2.5 Western blot分析

重組菌經(jīng)破碎儀破碎后，沉淀包涵體用GST純化柱純化，經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示，目的條帶初步得到純化（圖6）。并表明該蛋白具有生物學活性，可作為抗原用于本研究的ELISA方法建立。

圖6 目的蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of the expressed proteins

2.6 間接ELISA方法的建立

利用方陣滴定原理及各項試驗條件的優(yōu)化，最終確定間接ELISA方法的工作流程如下：以pH 9.6磷酸鹽作為包被緩沖液，VP6蛋白包被量為2μg／mL，每孔100μL，37℃孵育1h后4℃包被過夜；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加200μL的50g／L脫脂奶粉于37℃封閉2h；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加1∶40稀釋的待檢血清100μL，37℃孵育1h；200μL的PBST洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，每孔加羊抗豬酶標二抗100μL，37 ℃孵育30min；200μL的 PBST 洗滌5次，每次3min，最后1次拍干，依次加入底物A、底物B，各50μL，避光反應10min，最后加終止液50μL，10min內(nèi)用波長為630nm測每孔光吸收值。

間接免疫熒光鑒定的20份陰性血清，用建立的ELISA方法測定OD 630nm值，經(jīng)檢測，這20份陰性血清OD 630nm值的平均值為0.267，標準偏差為0.049，所以，當 OD 630nm 值≥0.267＋3×0.049即OD 630nm值≥0.414時為陽性，OD 630nm值＜0.414時為陰性。

2.7 特異性試驗

對PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV、PoRV這6種病毒陽性血清進行ELISA檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，與PoRV的陽性血清相比，其他5種陽性血清差異顯著，低于陽性判定值，說明建立的間接ELISA檢測方法特異性良好，無交叉反應（圖7）。

圖7 不同病毒抗體間交叉反應結(jié)果Fig.7 The ELISA results of cross reaction with antibodies against other viruses

2.8 敏感性試驗結(jié)果

對標準陽性血清進行4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 084倍稀釋，分別用建立的ELISA方法和間接免疫熒光試驗檢測。用建立的ELISA方法檢測，當陽性血清稀釋256倍時，OD 630nm值為0.563；而用間接免疫熒光檢測，當陽性血清稀釋128倍時，無陽性信號。因此，建立的間接ELISA方法比間接免疫熒光試驗的敏感高。

2.9 樣品檢測結(jié)果

檢測142份樣品進行符合率對比，建立的間接ELISA方法檢測為陰性37份，陽性105份；間接免疫熒光試驗檢測為陰性31份，陽性111份。以間接免疫熒光試驗為標準，陰性符合率為83.4%，陽性符合率為94.6%，總符合率為91.5%。然而檢測來自湖北、河北、江西、四川、福建等省份的臨床樣品639份，用于初步的流行病學調(diào)查，其中仔豬樣品117份，陰性43份，陽性74份，仔豬感染率為63.2%；保育豬樣品65份，陰性13份，陽性52份，保育豬感染率為65.0%；育肥豬樣品228份，陰性24份，陽性204份，育肥豬感染率為89.5%；母豬樣品229份，陰性8份，陽性221份，感染率為96.5%；總感染率為86.2%。各年齡段豬的感染率見圖8。

圖8 各年齡階段豬的豬輪狀病毒感染率Fig.8 The porcine rotavirus infection rates in each age stage pigs

3 討論

輪狀病毒屬于人畜共患病病原，據(jù)相關報道，全世界每年有527 000兒童死于A群輪狀病毒感染［14］。2010年冬季以來，我國發(fā)生仔豬病毒性腹瀉，也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

VP6蛋白以三聚體形式構(gòu)成RV的內(nèi)衣殼層，與外殼蛋白VP7、VP4及核心蛋白VP2相互作用，在維持RV的整體結(jié)構(gòu)中扮演重要角色［15］。同時，VP6蛋白也是輪狀病毒重要的群特異性抗原。因此，VP6蛋白是輪狀病毒感染血清抗體檢測的重要候選抗原［16］。本研究構(gòu)建豬輪狀病毒VP6重組蛋白的表達載體pGEX-KG-VP6，經(jīng)誘導表達，SDSPAGE和Western blot鑒定分析，重組蛋白獲得表達，有生物學活性，可作為本試驗建立的ELISA檢測方法的包被抗原。其中Western blot鑒定中，發(fā)現(xiàn)還有一條與目的條帶相近，大小約65ku條帶，經(jīng)分析，推測是由于70ku包涵體蛋白的降解產(chǎn)物，同樣有抗原性［17］。

ELISA技術(shù)具有操作簡便、敏感性高、特異性強、重復性好、價格低廉等優(yōu)點，在各實驗室及基層單位已普遍應用［18］。本研究利用建立的間接ELISA方法檢測臨床上未免疫豬輪狀病毒疫苗的血清639份，分析臨床上豬輪狀病毒自然感染率，其中，仔豬感染率為63.2%，保育豬感染率為65.0%，育肥豬感染率為89.5%，育肥豬感染率為89.5%，總感染率86.2%。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，隨著豬日齡的增長，輪狀病毒的感染也隨之增加。該研究結(jié)果為豬輪狀病毒的防控提供了技術(shù)支持和第一手基礎數(shù)據(jù)。

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Expression of VP6 and Development of An ELISA for Detection of IgG Antibodies against Porcine Rotavirus Group A

CHEN Shu-hua1，2，KU Xu-gang1，2，YAN Gui-wei1，2，DING Zhen-jiang1，2，HE Qi-gai1，2

（1.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，Wuhan，Hubei，430070，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan，Hubei，430070，China）

The aim of this research was to establish an indirect ELISA method for clinically detection of antibodies against porcine rotavirus Group A （PoRV）in pigs.VP6protein of Group A PoRV TM-a strain was successfully expressedinvitro.This recombinant protein was confirmed through SDS-PAGE and Western blot.The size of recombinant protein was 70ku and can be recognized by positive serum against PoRV.After optimization，2μg／mL of the protein was used to coat the plate，the dilution of clinical serum and HRP-conjugated antibody were 1∶40and 1∶4 000，respectively.The indirect ELASA detection method was established and used to detect clinical samples.Totally，142clinical samples were detected as positive according to our method and confirmed through indirect immunofluorescence assay（IFA）.The agreement of negative and positive were 83.4%，94.6%，resulting the general agreement of 91.5%between ELISA and IFA.This ELISA was further used to detect 638serum samples collected from different ages of swine to analyse the infection rate of PoRV in swine farm.The developed ELISA could be a convenient and accurate method for the epidemiological investigation of PoRV infection in pigs.

Porcine rotavirus；inner capsid protein VP6；indirect ELISA

S852.659.4；Q789

A

1007-5038（2014）07-0001-06

2014-01-10

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-36）

陳淑華（1987－），女，福建漳州人，獸醫(yī)碩士，主要從事豬傳染病防控研究。＊ 通訊作者