路明華，王雪敏，李淑芳，路迎迎，張培君，龔玉梅，王宏?。?/p>

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲 056021；3.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲 056021）

副豬嗜血桿菌單因子血清的制備＊

路明華1，2，王雪敏2，3，李淑芳1，路迎迎1，2，張培君1，龔玉梅1，王宏俊1＊

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲 056021；3.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲 056021）

利用副豬嗜血桿菌（Hps）的15個血清型的參考菌株分別制備相應(yīng)的兔抗血清，然后對抗血清進行交叉吸收試驗，得到15個血清型的單因子血清，不同血清型的單因子血清不與其他血清型抗原發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)用這15種單因子血清對臨床分離到的9株副豬嗜血桿菌進行血清型的鑒定，結(jié)果表明，其中6株為5型，2株為4型，1株為7型。

副豬嗜血桿菌；單因子血清；制備

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，Hps）屬于巴斯德菌科（Pasteurellaceae）嗜血桿菌屬（Hamophilus），為革蘭陰性細小桿菌，具有多種形態(tài)，定植于健康豬上呼吸道，屬于正常菌群，在免疫抑制等特定條件下會引起豬格氏病（Gl?sser's disease）［1－2］，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為主要特征。近些年來由于豬場規(guī)模化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，尤其是工廠集約化養(yǎng)殖，豬格氏病已經(jīng)呈世界性流行和暴發(fā)，表現(xiàn)出突然死亡率、發(fā)病率和病死率較高，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，并造成巨大經(jīng)濟損失［3－4］。

由于副豬嗜血桿菌（Hps）體外難以培養(yǎng)，直到1922年Schermer和Ehrlich才成功地分離到該菌。20世紀70年代，研究證明了Hps在體外培養(yǎng)過程中只依賴V因子，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而不需要正鐵血紅素（X因子），并將此菌更名為副豬嗜血桿菌［5－6］。

Kielstein P等［7］在1992年用瓊脂免疫擴散將Hps分為了15個血清型，但是目前對于血清型的鑒定仍然存在很多問題，例如不同血清型之間的交叉凝集反應(yīng)等。本研究利用Hps的15個參考菌株制備了單因子血清，試圖避免不同血清型間的交叉反應(yīng)，并對本實驗室分離和鑒定的副豬嗜血桿菌進行血清型的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副豬嗜血桿菌15個血清型的參考菌株來自澳大利亞昆士蘭州動物研究所，由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為加入50mL／L小牛血清和10g／L NAD的TSA平板；TSB液體培養(yǎng)基。

1.1.3 溶液、試劑 0.01mol／L PBS、硫柳汞和甲醛為中藥集團產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；2×PCR Mix為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-2C型電泳槽、DYY-2C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)為美國SIM BIO公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗血清的制備 ①抗原的制備：將－80℃凍存的Hps 15個血清型菌株劃線于TSA平板上進行復(fù)蘇，37℃過夜培養(yǎng)；將復(fù)蘇起來的各型菌進行擴大培養(yǎng)，之后每型菌株接種10個TSA平板，然后用加入了10g／L硫柳汞的PBS將菌體洗下，調(diào)整菌液濃度為109cfu／mL，加入2mL／L的甲醛，37℃36h，放4℃?zhèn)溆茫?－9］。②活菌檢驗：將滅活的菌液接種TSA板，觀察有無細菌生長。③免疫動物：首免分別取滅活的菌液1.5mL與1.5mL弗氏完全佐劑等量混合乳化均勻，于兔頸部皮下多點注射，1mL／只。首免2周后，用1.5mL滅活菌液與1.5mL弗氏不完全佐劑等量混合乳化均勻后于兔背部皮下多點注射，1mL／只。二免2周后于兔耳緣靜脈注射菌液1mL／只，每隔3d再免疫1次，最多免疫12次。期間，免疫3次后靜脈采血檢測抗體水平。④檢測有高效價抗體產(chǎn)生時，將實驗兔進行心臟采血，常規(guī)方法制備血清。

1.2.2 抗血清效價的測定 分別將15個血清型副豬嗜血桿菌菌液濃度調(diào)整為109cfu／mL，作為15個血清型的凝集抗原。各型血清稀釋度依次為1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。抗血清效價的測定采用玻片凝集法，取10μL 15種凝集原分別滴在玻片上，然后取10μL相應(yīng)不同稀釋度的抗血清與之混合，常溫放置3min內(nèi)觀察有無凝集發(fā)生。

1.2.3 交叉反應(yīng) 采用瓊脂擴散試驗（gel diffusion test，GDT）進行交叉反應(yīng)的測定。因為煮沸抗原的交叉反應(yīng)較低，所以試驗采用煮沸的方式制備抗原。將標準菌株接種TSA平板，長好的細菌菌落用pH 7.2的PBS洗下，調(diào)整菌懸液濃度為1.5×109cfu／mL，100 ℃ 60min，5 000r／min 離 心15min，取上清作為抗原。用PBS配制10g／L的瓊脂糖凝膠，用打孔器按孔徑3mm、孔間距4mm打孔，在相應(yīng)的孔中分別加入15μL血清和15μL抗原，放入濕盒中37℃放置24h觀察結(jié)果。如果血清孔和抗原孔之間出現(xiàn)沉淀帶為陽性，反之，則為陰性。

1.2.4 單因子血清的制備 根據(jù)交叉反應(yīng)的結(jié)果，抗血清選擇與其發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型的菌株進行吸收，具體方法為抗血清與菌液混合后，37℃孵育過夜，然后10 000r／min離心15min，取上清［10］。用瓊脂擴散試驗檢測上清液交叉反應(yīng)情況，如仍有交叉反應(yīng)，則再次進行吸附，直至不再出現(xiàn)交叉反應(yīng)，即只與本型菌株發(fā)生反應(yīng)，與其他菌株不發(fā)生反應(yīng)。

1.2.5 單因子血清效價的測定 采用常規(guī)玻片凝集法測定。凝集原采用1.2.2所制備的凝集原，取不同稀釋度的單因子血清分別與對應(yīng)血清型的凝集原做玻片凝集試驗，試驗方法同1.2.2。

1.2.6 Hps分離株的鑒定 本試驗對分離得到的9株菌利用Angen O等［11］報道合成3條特異性16S rRNA引物（表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

該引物擴增長度約1 090bp的片段。25μL體系：2×PCR Mix 12.5μL，HP1F3 0.6μL；HP2F2 0.6μL，HPRevx 1.5μL，ddH2O 8.8μL。程序設(shè)置為：94℃ 3min；94℃1min，56 ℃ 45s，72 ℃1min，35個循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.2.7 單因子血清的應(yīng)用 用制備的單因子血清對實驗室分離鑒定的9株Hps做瓊脂擴散試驗以確定其血清型。具體步驟：用PBS配制10g／L瓊脂糖，微波爐融化，然后倒入培養(yǎng)皿中待其凝固后，用打孔器用打孔器按孔徑3mm、孔間距4mm打孔，在中間孔加入15μL各型單因子血清，周圍孔加入15μL分離到的9株分離株制備的抗原，抗原制備按1.2.3方法；放入濕盒中37℃放置24h觀察結(jié)果。如果血清孔和抗原孔之間出現(xiàn)沉淀帶判為陽性，反之，則判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價測定結(jié)果

結(jié)果見表2。

表2 抗血清效價測定結(jié)果Table 2 Determination results of anti-serum titer

2.2 交叉反應(yīng)測定結(jié)果

由表3可以看出，1型、2型、5型、11型和12型血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)，其余各型無交叉現(xiàn)象出現(xiàn)。其中5型交叉反應(yīng)最為嚴重。

表3 交叉反應(yīng)試驗測定結(jié)果Table 3 Determination results of cross reaction test

2.3 單因子血清效價測定結(jié)果

由表4可以看出，1型和12型血清抗體效價未受影響，2型、5型和11型血清效價均降低了1個稀釋度，這是由于這3個型的血清交叉反應(yīng)嚴重，吸附菌液加入量大，故造成血清一定程度的稀釋，所以吸附后血清效價出現(xiàn)下降的情況。

表4 單因子血清效價測定結(jié)果Table 4 Determination results of uni-factor serum titer

2.4 Hps分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

由圖1可以看出，用特異性引物PCR擴增出的目的條帶與預(yù)期大小一致，故分離到的9株分離株均為副豬嗜血桿菌。

圖1 9株分離株P(guān)CR鑒定Fig.1 PCR identification of nine isolates

2.5 單因子血清應(yīng)用結(jié)果

用制備的單因子血清，對分離得到的9株Hps進行了血清型的鑒定，結(jié)果表明其中6株為5型，2株為4型，1株為7型，結(jié)果特異性良好，不存在交叉反應(yīng)，進一步證明了所制備的單因子血清可用于臨床分離株血清型的分型。

3 討論

在本試驗制備抗血清的過程中，不同菌株刺激機體產(chǎn)生抗體的時間差別很大，其中免疫3型抗原3次后血清中產(chǎn)生抗體；而免疫7型抗原10次后，采血檢測抗體仍為陰性，直到免疫12次后才檢測到抗體的存在。因為抗原的制備采用的方法和免疫的劑量各型之間完全相同，所以這不免使人想到免疫效果是否與菌株本身的血清型和抗原性有一定關(guān)系。另外，據(jù)報道，兔并不是Hps最敏感的實驗動物［12］，但與豬相比，兔要廉價很多；與較敏感的豚鼠相比，兔的血液量大的多，故綜合考慮兔仍作為實驗動物最佳選擇，而上述現(xiàn)象可能與兔個體本身的差異有關(guān)。

本試驗采用的是滅活菌株進行免疫接種，前期有些菌株并不能刺激機體產(chǎn)生抗體，于是后期采用了活菌加強免疫的辦法，之后抗體很快便產(chǎn)生。由此可見，滅活細菌在刺激機體產(chǎn)生抗體的程度上與活菌相比仍存在一些差距。同時，瓊擴試驗結(jié)果也表明，使用活菌接種容易產(chǎn)生交叉保護抗體，這與其他細菌的情況類似［13］。但活菌接種存在免疫劑量不易準確掌握的不足，免疫劑量稍大容易致使動物死亡。在制備滅活疫苗的時候應(yīng)考慮選用更好的佐劑，提升滅活抗原對動物機體的刺激程度及刺激時間。目前，在國內(nèi)外的研究中，很少有關(guān)于副豬嗜血桿菌滅活疫苗佐劑篩選方面的報道。

傳統(tǒng)方法制備的Hps抗血清存在較大的交叉反應(yīng)性，無法對菌株進行確切的分型。本試驗采用Hps 15個標準參考菌株，制備了相應(yīng)血清型的抗血清，并進行交叉反應(yīng)試驗，在此基礎(chǔ)上，采用高濃度少量的吸附方法對存在交叉的部分進行了吸附，除去交叉反應(yīng)部分的同時盡量避免了血清效價大幅度的降低，得到特異性較好的單因子血清；進一步用所獲得的單因子血清對分離到的Hps菌株進行血清型的分型，獲得了良好的結(jié)果。試驗過程中，采用了本實驗室保存的Hps標準血清對分離株進行了同樣的分型，但結(jié)果出現(xiàn)了較為嚴重的交叉反應(yīng)；由此可見，本試驗所制備的單因子血清較好的避免了分型過程中出現(xiàn)的交叉反應(yīng)，具有更好的特異性，為分離株血清型的確定提供了一種可行的方法，也為該疾病的防控提供了依據(jù)。

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Preparation of Uni-factor Serum ofHaemophilusparasuis

LU Ming-hua1，2，WANG Xue-min2，3，LI Shu-fang1，LU Ying－ying1，2，ZHANG Pei-jun1，GONG Yu-mei1，WANG Hong－jun1

（1.BeijingInstitutionofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，BAAFS；BeijingMunicipalKeyLaboratoryofAnimalDiseasePreventionandControlTechnology，Beijing，100097，China；2.CollegeofAgriculture，HebeiUniversityofEngineering，Handan，Hebei，056021，China；3.PoultryDiseasesEngineeringTechnologyResearchCenterofHebeiProvince，Handan，Hebei，056021，China）

The homologous antisera were gotten by utilizing the representative strains of theHaemophilus parasuis，and then 15mono-specific antisera were acquired by cross absorption and all mono-specific antisera showed serotype-specificity.Further investigations indicated that 2，1and 6of the nine isolates strains ofHaemophilusparasuis，respectively，belonges serotype 4，7and 5identified by using the 15mono-specific antisera.

Haemophilusparasuis；uni-factor serum；preparation

S852.613

A

1007-5038（2014）07-0021-04

2013-12-18

北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新能力建設(shè)項目（KJCX20140410）；“863”子課題項目（2011AA10A210）；國家自然科學(xué)基金項目（31272558，31001072）；河北省教育廳自然科學(xué)重點項目（ZH200811）

路明華（1987－），男，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事分子免疫學(xué)與預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。＊ 通訊作者