鄧 波，齊新永，葛 杰，沈莉萍，張維誼，周錦萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

一株豬源大腸埃希菌O119：K69的分離鑒定及藥敏試驗

鄧 波，齊新永，葛 杰，沈莉萍，張維誼，周錦萍＊

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

為了解某腹瀉豬群發(fā)病原因并進(jìn)行對癥治療，對該豬群1頭病死豬進(jìn)行病理剖檢，無菌采集心、肝、脾、肺、膽汁和結(jié)腸黏膜進(jìn)行病原學(xué)檢測，通過對結(jié)腸黏膜中分離的1株細(xì)菌進(jìn)行鑒別培養(yǎng)、VITEK鑒定和血清型診斷，鑒定出該細(xì)菌為大腸埃希菌O119：K69，并通過16種藥物的藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌僅對阿米卡星敏感，其他藥物均耐藥。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，結(jié)合補充電解多維、更換飼料和消毒等綜合措施對該豬群進(jìn)行治療，病情逐漸好轉(zhuǎn)。

大腸埃希菌O119∶K69；分離鑒定；藥敏試驗

近年來，大腸桿菌病日益成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要細(xì)菌性疾病，但由于大腸埃希菌復(fù)雜的血清型及全國各地區(qū)存在的大腸埃希菌耐藥性的差異，導(dǎo)致其防治越來越困難［1］。李迎曉等［2］從河南省分離到4株大腸埃希菌O8、O157、O117、O38對小鼠有較強的致死性，為致病性大腸埃希菌。在德國及一 些 歐 洲 國 家［3－4］，產(chǎn) 志 賀 毒 素 大 腸 埃 希 菌O114∶H7和腸出血性大腸埃希菌O104∶H4等疫情造成數(shù)千人感染，至少數(shù)十人死亡，這次疫情對整個歐洲都造成了一定的影響［3］。

抗菌藥在治療臨床疾病、維持動物健康和生產(chǎn)中起到了重要作用，但抗菌藥物使用得越多耐藥性亦變得越嚴(yán)重［6］?？股夭坏芤鸾邮苤委煹膫€體或群體體內(nèi)病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且能引起整個內(nèi)源菌群產(chǎn)生耐藥［7］。馬全朝等［8］研究了從上海市豬場分離到的致病大腸埃希菌對氨芐西林、四環(huán)素、利福平、甲氧芐啶、卡那霉素的耐藥性，結(jié)果表明耐藥率為80%～90%，菌株對7種～15種抗菌藥有耐藥性。李剛等［9］對青海地區(qū)18株致病性大腸埃希菌進(jìn)行的藥物敏感試驗結(jié)果表明，18株菌株對20種藥物均有不同程度的耐藥性，多重耐藥普遍存在，青霉素完全沒有抑菌作用。目前，磺胺類藥物對大腸桿菌病也不能起到很好的治療效果［10］，抗菌藥物使用頻度與細(xì)菌耐藥性呈正相關(guān)［11］。本研究通過對某發(fā)病病死豬的病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗，為指導(dǎo)臨床用藥及分析耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及背景 11月上旬，上海市寶山某農(nóng)戶送檢3月齡育肥肉豬1頭，該批豬存欄450頭，均為2月齡時從江蘇購回，病程1周左右，發(fā)病200頭，死亡80頭，主要癥狀為拉稀，呈黑色，無其他明顯臨床癥狀。該批豬購回后未免疫任何疫苗，發(fā)病后口服支原凈和土霉素，注射泰樂菌素和環(huán)丙沙星。經(jīng)剖檢，肺輕度實變，脾臟背面出血、邊緣有鋸齒狀梗死、胃底黏膜嚴(yán)重出血、腸壁增厚、回腸水腫。

無菌采集該病死豬心、肝、脾、肺、膽汁和結(jié)腸黏膜進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 Columbia 血瓊脂 （批號1219005），為Oxoid公司產(chǎn)品；羊血（批號131001），為寶絡(luò)生物公司產(chǎn)品；康凱瓊脂（批號130327），伊紅美藍(lán)瓊脂（批號130703），三糖鐵瓊脂（批號130619），SS 瓊脂（批號110812），MH 肉湯（批號120330），為北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 革蘭陰性菌鑒定卡（GNI＋），批號為S109M，由法國梅里埃公司提供；腸道致病性大腸埃希菌診斷血清（批號20130101），腸道侵襲性大腸埃希菌診斷血清（批號20130501），腸道產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清（批號20130501）為寧波天潤生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌（ATCC25922、ATCC35218）為中國獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品；藥敏紙片（批號120614）為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng) 將無菌采集的病料心、肝、脾、肺、膽汁和結(jié)腸黏膜分別接種血瓊脂板，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36℃培養(yǎng)24h，挑取可疑菌落涂片鏡檢并純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)物分別接種于麥康凱、伊紅美藍(lán)、巧克力瓊脂、SS瓊脂等培養(yǎng)基，觀察其培養(yǎng)特性。

1.2.2 VITEK鑒定 對分離的細(xì)菌純培養(yǎng)物按照細(xì)菌鑒定卡操作規(guī)程進(jìn)行操作，并在VITEK-32全自動細(xì)菌鑒定儀上讀取細(xì)菌鑒定結(jié)果。

1.2.3 大腸埃希菌血清型診斷 于潔凈玻片上滴1滴診斷血清，然后取被檢菌少許與血清混勻，輕輕搖動玻片，試驗應(yīng)以生理鹽水溶液做對照。1min內(nèi)呈明顯凝集，＋＋＋以上者判為陽性，呈均勻渾濁者為陰性。

通過大腸埃希菌純培養(yǎng)物先與OK多價血清做玻片凝集試驗，陽性時，再以所屬的OK單價血清于原處取培養(yǎng)物做凝集試驗，以確定菌群。如與某個單價血清凝集，再以該血清與3個以上菌落做凝集試驗，陽性時，選強凝集的菌落移種到三糖鐵培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃培養(yǎng)18h后，觀察結(jié)果，并制成濃厚菌液，于100℃水浴中加熱30min，再與相應(yīng)的OK單價血清或O單價血清做玻片凝集試驗，如仍為陽性，則可與其生化特性綜合做出診斷。

1.2.4 藥敏試驗 將細(xì)菌純培養(yǎng)物菌落濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管，接種MH瓊脂平板，采用紙片法進(jìn)行體外藥敏試驗，35℃培養(yǎng)18h觀察結(jié)果。試驗方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS 2010標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性

從結(jié)腸黏膜中分離到圓形凸起、光滑、濕潤、半透明的灰白色菌落，直徑約2.4mm，在Columbia羊血平板上呈β溶血；經(jīng)革蘭染色為陰性短桿菌；在麥康凱瓊脂上形成中等大小、圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的亮紅色小菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成帶有金屬光澤的黑色菌落；在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上生長形成中等大小、圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的白色菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上未見生長；在三糖鐵瓊脂斜面和穿刺部分變黃、產(chǎn)生氣泡。

2.2 分離菌株生化特性鑒定

根據(jù)培養(yǎng)特性，選擇革蘭陰性菌鑒定卡（GNI＋）。分離菌在VITEK-32全自動細(xì)菌鑒定儀上鑒定結(jié)果為大腸埃希菌（Escherichiacoli），生化特性詳見表1。

2.3 大腸埃希菌血清學(xué)診斷

根據(jù)VITEK結(jié)果，選擇大腸埃希菌血清學(xué)診斷試劑對分離菌進(jìn)行凝集試驗，結(jié)果為大腸埃希菌O119：K69。

2.4 藥敏試驗

分離的大腸埃希菌O119：K69對阿米卡星敏感，抑菌圈為20mm，無中介，其他15種藥物均表現(xiàn)耐藥，詳見表2。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果Table 1 Results of biochemical test of bacterial strain

表2 分離株藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of drug susceptibility tests for bacterial strain

3 討論

根據(jù)主訴，樣品來源豬群為保育豬，且發(fā)病率和病死率分別為44.4%和40%，通常情況下保育豬單純大腸埃希菌感染沒有這么高的致死率，本試驗又對樣品中流行性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒和豬增生性腸炎進(jìn)行了檢測，3種病毒的PCR檢測結(jié)果均為陰性，豬增生性腸炎檢測結(jié)果為陽性，故懷疑豬群存在混合感染。但胞內(nèi)勞森菌目前有待進(jìn)一步分離鑒定。

孫廣力等［12］于2004年在仔豬病料中分離到77株8種抗O型血清型大腸埃希菌，其中7種接種小鼠后導(dǎo)致小鼠發(fā)病和致死。根據(jù)寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供的大腸埃希菌診斷血清的分類，大腸埃希菌O119：K69屬于腸道致病性大腸埃希菌，下一步準(zhǔn)備對本試驗的分離菌開展小鼠致病性試驗以對其致病性進(jìn)行確認(rèn)。

據(jù)相關(guān)報道，細(xì)菌的藥敏試驗及聯(lián)合藥敏試驗與臨診療效的符合率可達(dá)到80%左右，因此對細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定和藥敏試驗從而根據(jù)該細(xì)菌的特性和藥敏的結(jié)果，選用合適的抗菌藥和治療措施，對于細(xì)菌學(xué)疾病的診斷具有重要意義。通常情況下大腸埃希菌感染應(yīng)選擇氨基糖苷類、氟喹諾酮類抗生素；在考慮藥物的動力學(xué)、藥效學(xué)特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合畜禽的病情、體況制定合理的給藥方案；防止藥物的不良反應(yīng)和殘留；合理聯(lián)合用藥，根據(jù)抗菌藥的作用特性和機(jī)理進(jìn)行選擇和組合，防止盲目聯(lián)合；避免耐藥性的產(chǎn)生。

我國很多地區(qū)的獸醫(yī)從業(yè)者沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)，沒有執(zhí)行或缺少抗菌藥的使用規(guī)范，抗生素的不合理使用甚至是濫用的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，根據(jù)近年來本實驗室對大腸埃希菌16種常用抗生素的耐藥性監(jiān)測結(jié)果表明，大腸埃希菌多存在10到11重耐藥，故臨診治療時應(yīng)根據(jù)正確的診斷選擇合適的物采取綜合措施，對癥治療，盡量減少使用或不適用抗生素。

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，畜主對豬群肌肉注射硫酸阿米卡星、電解多維飲水、環(huán)境消毒、減少飼喂和更換全價飼料等綜合措施，豬群發(fā)病情況明顯好轉(zhuǎn)，1周后無突然死亡病例，2周左右后基本無拉稀發(fā)生。

致病性大腸埃希菌主要存在于母豬的腸道、產(chǎn)道及周圍環(huán)境中，通過消化道感染，帶菌母豬是本病的主要傳染源。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，豬大腸桿菌病的發(fā)生沒有明顯的季節(jié)性，季節(jié)交替、極寒炎熱、氣候多變、天氣濕冷等情況下易出現(xiàn)該病，消毒不徹底、飼養(yǎng)管理不規(guī)范、衛(wèi)生條件不合格、飼料驟變等應(yīng)激因素可促使本病發(fā)生。該病的流行病學(xué)特點可以為其防治提供理論參考依據(jù)。

使用1g／L的高錳酸鉀水溶液對發(fā)病豬皮膚、黏膜及母豬產(chǎn)床進(jìn)行消毒；嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)供給母豬全價飼料，仔豬斷奶前后合理控制飼料的供給；加強仔豬的飼養(yǎng)管理；做好防寒避暑；根據(jù)豬群生長發(fā)育特點及時補充鐵、硒等微量元素以增強機(jī)體的抗病能力，為該病起到一定的預(yù)防作用。

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Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of OneEscherichiacoliO119：K69in Swine

DENG Bo，QI Xin-yong，GE Jie，SHEN Li-ping，ZHANG Wei-yi，ZHOU Jin-ping

（ShanghaiCenterofAnimalDiseaseControl，Shanghai，201103，China）

In order to determine the pathogen of diarrheic herd and provide correct treatment，one dead pig was examined pathologically.The heart，liver，spleen，lung，bile and colon mucosa were collected and detected.Based on the differential culture，VITEK identification and serological diagnosis，a strain ofEscherichiacoliO119：K69was identified.Through the sensitivity test of sixteen kinds of drugs，the bacterial strain was only sensitive to amikacin，and other drugs were all resistant.According to the results of drug sensitivity test，the comprehensive measures combined improving dehydration，replacing feed and disinfection treatment of the herd make the herd recovered gradually.

EscherichiacoliO119：K69；differential culture；drug sensitivity test

S852.612；S858.28

B

1007-5038（2014）07-0121-04

2013-12-11

鄧 波（1982－），湖北人，男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事重大動物疫病及人畜共患病檢測工作。＊通訊作者