謝秀蘭，劉溪源，王建東，范春梅，康曉冬＊，薛 偉

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏銀川市金鳳區(qū)農(nóng)牧水務(wù)局，寧夏銀川 750002）

乳源金黃色葡萄球菌9種腸毒素基因的檢測(cè)＊

謝秀蘭1，劉溪源2，王建東1，范春梅3，康曉冬1＊，薛 偉1

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏銀川市金鳳區(qū)農(nóng)牧水務(wù)局，寧夏銀川 750002）

為比較臨床型和隱性奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分布差異，采用PCR方法對(duì)70株臨床乳房炎和55株隱性乳房炎金黃色葡萄球菌（SA）菌株進(jìn)行9種腸毒素基因的檢測(cè)。結(jié)果表明，在臨床乳房炎SA中，腸毒素基因的攜帶率為65.7%，各型腸毒素基因的檢出率分別為SEA 12.9%（9株）、SEE 4.3%（3株）、SEI 60.0%（42株），沒(méi)有檢出 SEB、SEC、SED、SEG、SEH、SEJ，攜帶1種腸毒素基因的占55.7%（38株），同時(shí)攜帶2種及以上腸毒素基因的占11.4%（8株）；在隱性乳房炎SA中，腸毒素基因的攜帶率為89.1%，各型腸毒素基因的檢出率分別為 SEA 10.9%（6株）、SEB 25.5%（14株）、SEC 7.3%（4株）、SED 5.5%（3 株）、SEE 25.5%（14株）、SEG 47.3%（26株）、SEH 29.1%（16株）、SEI 10.9%（6株）、SEJ 32.7%（18株）。其中攜帶1種腸毒素基因的占29.1%（16株），同時(shí)攜帶2種及以上腸毒素基因的占60.0%（33株）。結(jié)果表明，奶牛乳房炎SA菌株中，腸毒素基因的攜帶率很高，在臨床型乳房炎中以SEI為主，而隱性乳房炎中，腸毒素基因檢出率更高、腸毒素基因種類更多，組合型也更復(fù)雜。

奶牛；乳房炎；金黃色葡萄球菌；腸毒素；聚合酶鏈反應(yīng)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，可引起奶牛臨床和隱性乳房炎，攜帶有金黃色葡萄球菌的奶?？芍苯游廴灸淘?，給奶牛場(chǎng)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶，包括腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）、溶血毒素、殺白細(xì)胞素（paton-valentine leukocidin，PVL）、血漿凝固酶等。腸素素是其中起主要作用的致病因子，具有多個(gè)基因型，它是由一組結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的細(xì)胞外蛋白組成，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5種傳統(tǒng)的血清型外，還發(fā)現(xiàn)了SEG、SEH、SEI、SEJ等新型的腸毒素［2－4］。本研究以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)寧夏部分地區(qū)奶牛場(chǎng)的臨床和隱性乳房炎金黃色葡萄球菌的9種腸毒素基因進(jìn)行檢測(cè)，為該地區(qū)奶牛及其產(chǎn)品的安全評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 70株臨床型乳房炎金黃色葡萄球菌菌株，55株隱性乳房炎金黃色葡萄球菌菌株分離自寧夏吳忠、石嘴山和靈武奶牛養(yǎng)殖園區(qū)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）菌株，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供。

1.1.2 主要試劑 溶菌酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Master PCR Mix、DNA Marker DL 2 000為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌的DNA，具體操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，提取的基因組DNA溶于80μL TE溶液中，置－20℃保存。

1.2.2 PCR檢測(cè)nuc基因 由于一些非金黃色葡萄球菌菌株可能會(huì)產(chǎn)生活性很高的假凝固酶，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增耐熱核酸酶基因（nuc）的方法［5］對(duì)所有SA菌株進(jìn)一步驗(yàn)證，以減少假陽(yáng)性，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增執(zhí)行以下程序：以提取的DNA為模板，使用一管便捷式PCR擴(kuò)增試劑盒，反應(yīng)體系25μL，體系內(nèi)各組分按說(shuō)明書加樣。PCR反應(yīng)條件：94℃，3min；94℃1min，55℃30s，72 ℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃3.5min，12℃結(jié)束反應(yīng)。

表1 nuc基因引物序列Table 1 The primer sequences of nuc gene

1.2.3 9種腸毒素基因PCR引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)劉繼超等［6］報(bào)道進(jìn)行 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEH基因的引物合成和擴(kuò)增條件，根據(jù)Peles F等［7］報(bào)道進(jìn)行SEG、SEI、SEJ基因的引物合成和擴(kuò)增條件。為減少干擾，每種腸毒素基因均單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表2。9種腸毒素基因的PCR擴(kuò)增均執(zhí)行以下反應(yīng)體系：以提取的DNA為模板，使用一管便捷式PCR擴(kuò)增試劑盒，反應(yīng)體系25μL，體系內(nèi)各組分按說(shuō)明書加樣。SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SHE基因的PCR擴(kuò)增條件：94℃4min；94℃1min，48℃45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，12℃結(jié)束反應(yīng)。SEG、SEI、SEJ基

因的PCR擴(kuò)增條件：94℃4min；94℃1min，56℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，12℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 電泳 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為15g／L，利用標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker，觀察電泳完成后的擴(kuò)增片段，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)SA菌株的nuc基因PCR檢測(cè)結(jié)果表明，70株臨床型乳房炎SA菌株，55株隱性型乳房炎SA菌株的均為nuc基因陽(yáng)性。部分SA菌株的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 9種腸毒素基因PCR擴(kuò)增引物Table 2 The primers of 9staphylococcal enterotoxin genes

圖1 nuc基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of nuc gene PCR products

2.2 腸毒素基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)125株金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)，檢出了 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEH、SEG、SEI、SEJ 9種腸毒素基因。擴(kuò)增片段大小如圖2所示，分別為120、478、257、319、170、375、704、630、142bp。

圖2 9種腸毒素基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 9enterotoxin genes

2.3 腸毒素基因的分布

在70株臨床乳房炎SA菌株中，9種腸毒素基因的攜帶率為65.7%，在隱性乳房炎SA菌株中，9種腸毒素基因的攜帶率為89.1%。各種腸毒素基因的檢出情況見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，在臨床乳房炎SA菌株中，SEI的檢出率最高，沒(méi)有檢測(cè)到SEB、SEC、SED、SEH、SEG、SEJ基因。在隱性乳房炎SA菌株中，SEG、SEJ、SHE的檢出率最高，9種腸毒素都有檢出。各種腸毒素基因的組合流行情況見(jiàn)表4，臨床型乳房炎SA菌株中，攜帶1種腸毒素基因的有38株（54.3%），2種的有8株（11.4%）；隱性乳房炎SA菌株中，攜帶1種腸毒素基因的有16株（29.1%），2種及以上的有33株（60.0%），其中同時(shí)攜帶2種的有15株（27.3%），同時(shí)攜帶 3種的有12株（21.8%），同時(shí)攜帶4種的有5株（9.1%），同時(shí)攜帶5種的有1株（1.8%）。

表3 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌菌株腸毒素基因分布Table 3 Distribution of enterotoxins genes of S.aureus from bovine mastitis

表4 腸毒素基因的組合流行情況Table 4 Combination epidemics of S.aureus enterotoxin genes

3 討論

研究所用的125株SA菌株分離自寧夏吳忠、石嘴山、靈武大型奶牛養(yǎng)殖園區(qū)，對(duì)其腸毒素基因的研究，可為寧夏地區(qū)奶牛及其產(chǎn)品的安全評(píng)估提供一定理論依據(jù)。

研究結(jié)果表明，臨床型和隱性型乳房炎腸毒素基因的攜帶率分別為65.7%和92.7%。而國(guó)內(nèi)王新等［8］報(bào)道的臨床型和隱性型乳房炎奶牛金黃色葡萄球菌腸毒素基因的陽(yáng)性比例分別為34.6%和7.0%，馬保臣等［9］報(bào)道的臨床型乳房炎27.42%和隱性型乳房炎1.41%，夏勝超等［10］報(bào)道的臨床型乳房炎31.3%和隱性型乳房炎47.1%，張靜等［11］報(bào)道臨床型乳房炎的檢出率為77.19%，國(guó)外報(bào)道腸毒素基因檢出率在4%～67%［3－4，12］，說(shuō)明奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌腸毒素基因的流行病學(xué)可能存在地域相關(guān)性，同時(shí)研究結(jié)果表明寧夏地區(qū)的奶牛場(chǎng)存在著很大的安全隱患，尤其是隱性乳房炎攜帶的腸毒素基因更多，揭示了乳及乳制品從來(lái)源到成品都存在很大的安全風(fēng)險(xiǎn)。

此外，臨床型乳房炎中，腸素素基因攜帶率最高的是SEI基因（42株，60.0%），這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相似。此外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床型乳房炎和隱性乳房炎中都含有一定量的含有2個(gè)或2個(gè)以上基因型的腸毒素基因，但其中隱性乳房炎金黃色葡萄球菌菌株攜帶的腸毒素基因檢出率更高，腸毒素基因種類更多，組合型也更復(fù)雜，其原因尚不清楚。

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Detection of 9 Enterotoxin Genes inStaphylococcusaureusFrom Milk of Cows with Mastitis

XIE Xiu-lan1，LIU Xi-yuan2，WANG Jian-dong1，F(xiàn)AN Chun-mei3，KANG Xiao-dong1，XUE Wei1

（1.ResearchCenterofGrassandLivestock，NingxiaAcademyofAgricultureandForestrySciences，Yinchuan，Ningxia，750002，China；2.AgriculturalCollege，NingxiaUniversity，Yinchuan，Ningxia，750002，China；3.JinfengBureauofAgriculture，WaterandAnimalHusbandry，Yinchuan，Ningxia，750002，China）

The aim of this study was to compare the difference of occurrence of 9enterotoxin genes inStatphylococcusaureusrecovered from milk of cows with clinical or subclinical mastitis.70and 55S.aureusstrains from cows with clinical and subclinical mastitis were isolated，respectively，and 9enterotoxin genes were tested by using PCR method.The results showed that an overall of 65.7%isolates from cows with cinical mastitis carried enterotoxin genes，and the detection rates of SEA，SEE and SEI were 12.9% （9 isolates），4.3%（3isolates）and 60.0%（42isolates），respectively.Among these isolates，55.7% （38isolates）of them possessed one type of enterotoxin gene，while 11.4% （8isolates）of them possessed more than two gens.For isolates from cows with subclinical mastitis，89.1%of them carried enterotoxin genes，and the detection rates of SEA，SEB，SEC，SED，SEE，SEG，SEH，SEI and SEJ were 10.9% （6isolates），25.5%（14isolates），7.3%（4isolates），5.5%（3isolates），25.5%（14isolates），47.3% （26isolates），29.1% （16isolates），10.9% （6isolates）and 32.7% （18isolates），respectively.Among these isolates，29.1% （16isolates）of them possessed one type of enterotoxin gene，while 60.0% （33isolates）of them possessed more than two gens.Our results indicated that enterotoxin genes were wildly distributed in mastitis-relatedS.aureusstrains.It is also suggested that inS.aureusstrains related with clinical mastitis，SEI was the prominent enterotoxin，while in strains related with subclinical mastitis，more types and more complex of enterotoxin genes were presented.

cow；mastitis；Statphylococcusaureus；enterotoxin；polymerase chain reaction（PCR）

S852.611

A

1007-5038（2014）07-0025-04

2013-12-30

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NZ12255）

謝秀蘭（1980－），女，寧夏平羅人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。＊ 通訊作者