孫淑明 林豪雨 盧曉峰 梁偉全 謝舜峰

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 汕頭 515041）

外周血中PIPmRNA的表達(dá)及在乳腺癌微轉(zhuǎn)移中的臨床意義

孫淑明 林豪雨 盧曉峰 梁偉全 謝舜峰

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 汕頭 515041）

目的 探討泌乳素誘導(dǎo)蛋白( PIP) mRNA對(duì)乳腺癌微轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)75例乳腺癌患者、21例乳腺良性病變患者和20例健康者外周血中PIPmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 75例乳腺癌患者外周血中PIP mRNA有23例表達(dá)，陽性率為30.7%，乳腺良性腫瘤組和對(duì)照組中PIP mRNA表達(dá)為陰性。兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。PIPmRNA 陽性表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、原發(fā)腫瘤大小、分期顯著相關(guān)（P＜0.05）；而與患者的年齡、病理類型、ER、PR 等無顯著相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論 外周血PIP mRNA陽性表達(dá)與乳腺癌微轉(zhuǎn)移有關(guān)。

泌乳素誘導(dǎo)蛋白；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；乳腺腫瘤；微轉(zhuǎn)移

Fisher等認(rèn)為乳腺癌是一種全身性疾病的局部表現(xiàn)，治療效果取決于確診時(shí)有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌致死的主要原因。若在亞臨床階段就能檢測(cè)到微轉(zhuǎn)移，那么對(duì)指導(dǎo)臨床的治療和判斷患者的預(yù)后都具有重要的實(shí)際意義。我們應(yīng)用RT-PCR法，檢測(cè)乳腺癌患者外周血中PIP mRNA的表達(dá)，探討PIP mRNA與乳腺癌微轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，從而為臨床上診斷乳腺癌微轉(zhuǎn)移提供指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年8月至2010年7月在我院住院，經(jīng)病理確診的乳腺癌75例（女性74例，男性1例），平均年齡48.5歲（28～82歲）。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌63例、髓樣癌4例、導(dǎo)管原位癌4例、黏液腺癌3例、粉刺癌1例。按TNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期47例、Ⅲ期15例、Ⅳ期5例。同期采集21例乳腺良性腫瘤患者和20例健康者（無乳腺疾病及其他腫瘤病史的女性）。全部患者在入院治療前均未行任何抗腫瘤治療，且具有完整的病理及病歷資料。

1.2 試劑及引物

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq和DNA Marker （大連寶生物公司）；引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。PIPmRNA[1]的預(yù)期擴(kuò)增片段為172 bp；上游引物：5'-GGCCAACAAAGCTCAGGACAAC-3'，下游引物：5'-TGCA CCTTGTAGAGGGATGCTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及保存：清晨空腹抽取外周淺靜脈血6 mL，立即加入EDTA抗凝試管，在2 h內(nèi)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，在液態(tài)氮中速凍15 min后放入-80 ℃冰箱中保存待用。全部按嚴(yán)格無菌操作采集標(biāo)本。

1.3.2 RT-PCR反應(yīng)：按一步法提取總RNA（TRIZOL法），根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PremixTaq說明書介紹的方法嚴(yán)格操作。用乳腺癌組織的cDNA作為陽性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照。

1.3.3 產(chǎn)物鑒定：由上海生工生物工程公司對(duì)PIPmRNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測(cè)序并鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16·0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、一致性檢驗(yàn)用Kappa值分析、等級(jí)資料用Kendall進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 PIP mRNA的陽性表達(dá)：75例乳腺癌患者外周血標(biāo)本中，有23例出現(xiàn)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為30.7%。乳腺良性腫瘤21例和健康對(duì)照組20例的外周血中均沒有表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PIPmRNA在各組中的表達(dá)情況（表1）。

表1 PIPmRNA在各組的表達(dá)情況

2.2 PIP mRNA 的陽性率與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

癌瘤的大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PIP mRNA 的陽性率成正相關(guān)關(guān)系。PIP mRNA 的陽性率隨癌瘤直徑的增大而明顯升高，在癌瘤直徑≤2 cm、2.0～5.0 cm及≥5 cm中，PIP mRNA的陽性率為12.5%、59.6%及75.0%，差異有顯著性（P＜0.05）；臨床Ⅲ～Ⅳ期患者PIP mRNA的陽性表達(dá)率為60.0%（12/20），顯著高于Ⅰ、Ⅱ期的12.5%和19.1%（P＜0.05）（表2）。PIP mRNA的陽性表達(dá)率與患者病理類型、年齡、月經(jīng)狀況未見有顯著性關(guān)系（表3）。 PIPmRNA的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系見表2。

表2 乳腺癌組PIPm RNA的表達(dá)與TNM分期的關(guān)系

2.3 乳腺癌組PIPmRNA的陽性率與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

見表3。

表3 乳腺癌組PIPmRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 測(cè)序結(jié)果

由上海生工生物工程公司對(duì)PCR產(chǎn)物做純化、測(cè)序，用GenBank基因序列作同源性對(duì)比，擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基因得到證實(shí)。

3 討 論

Fisher通過大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究明確指出乳腺癌在確診時(shí)約50%己有微小轉(zhuǎn)移病灶，即使早期乳癌也可能是全身性疾病。乳腺癌死亡的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，如果能在亞臨床階段發(fā)現(xiàn)與乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，并對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期干預(yù)，則對(duì)提高乳腺癌患者的生存率、降低病死率具有重要臨床意義。

外周血微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)以其能反復(fù)采集標(biāo)本，檢查方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，便于隨訪監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。通過檢測(cè)外周血特異性標(biāo)志物來診斷乳腺癌微轉(zhuǎn)移，成為目前研究熱點(diǎn)之一。PIP被認(rèn)為是一個(gè)特異性強(qiáng)且高度敏感的頂質(zhì)分泌細(xì)胞標(biāo)志物[2]，該蛋白基因位于人7號(hào)染色體q34位點(diǎn)，能與CD4+T細(xì)胞受體結(jié)合，從而抑制CD4介導(dǎo)的T細(xì)胞程序性死亡。近年來，RT-PCR法因高靈敏性而常常用于做為對(duì)各種實(shí)體瘤微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法[3,4]。Ring等[5]報(bào)道通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，將PIP作為檢測(cè)乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物之一。我們用RT-PCR方法對(duì)75例乳腺癌患者外周血中PIPmRNA檢測(cè)，結(jié)果有23例檢出有特征性172 bp擴(kuò)增條帶，陽性率為30.7%（23/75），而乳腺良性21例和健康者20例外周血均未查出有PIP mRNA，特異性 100%，跟文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

近年研究表明，PIP 基因或蛋白高表達(dá)可作為乳腺癌特異標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)早期微小轉(zhuǎn)移，并提示生存預(yù)后不佳[6-8]。將本實(shí)驗(yàn)75例乳腺癌患者分為有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2組進(jìn)行分析，結(jié)果有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 PIPmRNA 的陽性率為66.7%，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性率為10.0%，即伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，PIPmRNA的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.006）。說明乳腺癌患者外周血PIPmRNA陽性率與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有顯著性相關(guān)，外周血中PIP mRNA陽性表達(dá)在一定程度上能夠反映疾病的分期，而腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一，也進(jìn)一步闡明微轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、預(yù)后的關(guān)系。Mitas等[9]采用RT-PCR對(duì)17個(gè)有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和51個(gè)無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)作對(duì)照進(jìn)行檢查，結(jié)果PIP的準(zhǔn)確率為93.3%，認(rèn)為PIP具有檢測(cè)乳腺癌微小轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值。鄭振東等[10]對(duì)50例乳腺癌患者外周血標(biāo)本中，化療前17例PIP mRNA陽性的患者，經(jīng)2～3個(gè)周期化療后有13例轉(zhuǎn)為陰性，其轉(zhuǎn)陰率為76.5%，而在化療前PIPmRNA表達(dá)陰性的患者經(jīng)化療后全部無轉(zhuǎn)為陽性病例，化療前、后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）。由此可見，乳腺癌患者術(shù)后輔助化療能夠降低血液PIP mRNA的陽性率，有望減少乳腺癌血液微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表達(dá)，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、治療效果的判斷及預(yù)測(cè)預(yù)后具有實(shí)際臨床意義。

臨床資料表明，乳腺癌病期越晚，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)越大，治療效果越差。我們75例資料顯示：Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血PIP mRNA的陽性表達(dá)率（60%）明顯高于Ⅰ（12.5%）、Ⅱ期（19.1%）患者（P=0.048＜0.05），可見病程越晚，出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性也越大，同時(shí)Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌分別有12.5%和19.1%的陽性表達(dá)，提示早期乳腺癌也存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能，這也能解釋為什么部分早期乳腺癌患者預(yù)后較差的原因，因此臨床上在制訂治療方案前盡可能對(duì)是否存在微轉(zhuǎn)移作出診斷，有針對(duì)性制訂出多學(xué)科綜合的治療方案，提高乳腺癌的治療效果。

本研究也顯示乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表達(dá)除與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)外，與患者年齡、月經(jīng)狀況、病理類型、腫瘤分化程度、ER、PR及HER-2等表達(dá)無關(guān)。PIP mRNA表達(dá)下調(diào)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、黏附和侵襲能力，提示PIP mRNA與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，其發(fā)揮作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。相信隨著人們對(duì)PIP mRNA在腫瘤細(xì)胞中功能和作用機(jī)制研究的不斷深入，必將為以PIP mRNA為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療帶來希望。

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Clinical Significance of PIPmRNA Expression of Peripheral Blood in Micrometastasis of Breast Cancer

SUN Shu-ming, LIN Hao-yu, LU Xiao-feng, LIANG Wei-quan,XIE Shun-feng
(Department of Thyroid and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

Objective To assess the prognosis values of prolactin-induced protein(PIP) mRNA in breast carcinoma and tumor micrometastasis. Methods Peripheral serum samples of 75 patients with breast carcinoma, 21 patients with benign breast lesions and 20 controls were collected, PIP mRNA was assessed by RT-PCR. Results The positive rate of PIPmRNA in breast carcinoma patients, benign breast lesions and controls group was 30.7%, 0% and 0%. Significant differences were found in the expression of PIPmRNA in peripheral serum among patients with control groups, benign breast lesions patients with breast carcinoma (P＜0.05). The positive rates and related of PIPmRNA was significantly correlated with clinical stage (P＜0.05). There were no significant differences among any of age,histopathology types,estrogen receptor and progesterone receptor(P＞0.05). Conclusion Breast carcinoma and tumor micrometastasis patients with positive PIP mRNA was a close relationship.

Prolactin-induced protein; Reverse transcription polymerase chain reaction; Breast neoplasms; Tumor micrometastasis

R737.9

：B

：1671-8194（2014）05-0005-03

汕頭市科技局資助項(xiàng)目（2011-181）