趙宏 王琦 王昌華 趙守華

1.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院胸心外科，山東 滕州 277500；

2.山東省棗莊市薛城區(qū)周營鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院外科，山東 棗莊 277000

NFAT蛋白各亞型在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理因素間的關(guān)系

趙宏1 王琦2 王昌華1 趙守華1

1.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院胸心外科，山東 滕州 277500；

2.山東省棗莊市薛城區(qū)周營鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院外科，山東 棗莊 277000

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)，活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)與多種惡性腫瘤關(guān)系密切，食管鱗癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。本研究探討食管鱗癌組織NFAT各亞型的表達及其與食管鱗癌各臨床病理因素的關(guān)系。方法：采用免疫組化法檢測104例食管鱗癌組織和癌旁食管黏膜組織中NFAT各亞型的表達情況。結(jié)果：NFAT1～4在食管鱗癌組織中陽性表達率分別為53.8%、10.6%、26.9%和45.2%，與在癌旁食管黏膜組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。NFAT1的表達與飲酒史(62.3% vs 37.1%，P=0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(68.4% vs 5.5%，P=0.002)及較晚的分期(58.7% vs 36.2%，P=0.02)密切相關(guān)，多因素分析提示NFAT1過表達僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的NFAT3表達率(39.4%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(19.7%)。結(jié)論：NFAT蛋白在食管鱗癌組織中過表達，NFAT1與NFAT3的表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。

食管癌；活化T細胞核因子；轉(zhuǎn)移

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中90%是食管鱗狀細胞癌［1］，盡管近年來其診治水平有了很大進步，但食管癌患者的5年生存率仍然不高，因此發(fā)現(xiàn)具有診斷和治療意義的分子靶點對于改善這一疾病的預(yù)后有著極為重要的作用?；罨疶細胞核因子(nuclear factor of activated Tcells，NFAT)最初作為在活化T細胞IL-2啟動子上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子而被發(fā)現(xiàn)［2］，后來研究發(fā)現(xiàn)NFAT家族作為細胞內(nèi)多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子，在調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞轉(zhuǎn)化和生長、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面也發(fā)揮著重要的作用，與腫瘤形成和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。目前鮮見NFAT與食管鱗癌關(guān)系的研究報道，本研究旨在觀察NFAT蛋白各亞型在食管鱗癌組織中的表達情況。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2007年1月—2007年12月間在我院接受手術(shù)治療的原發(fā)性食管鱗癌患者104例，術(shù)前均未接受放化療。所有患者均具有詳細的臨床病理資料。其中男性73例，女性31例；高分化8例，中分化77例，低分化19例；Ⅰ期和Ⅱ期58例，Ⅲ期46例(表1)。

表1 臨床病理資料Tab. 1 The clinical pathological data

1.2 試劑與方法

所有石蠟標本的HE染色切片均經(jīng)病理醫(yī)師閱片確診，每例患者分別標記2個食管癌組織點以及2個距癌5 cm遠的正常食管組織點，制備組織芯片。組織芯片上，每個組織點直徑1 mm，每個患者包括4個點。連續(xù)切片厚度4 μm。兔抗人NFAT的抗體購自英國Abcam公司(編號依次為ab2722、ab25916、ab3447及ab83832，工作濃度分別為NFAT1 1∶100，NFAT2 1∶10，NFAT3 1∶50，NFAT4 1∶10)。PV9000及DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。微波爐中高火5 min、中低火15 min進行抗原熱修復(fù)，3%雙氧水、80%甲醇室溫30 min消除內(nèi)源性過氧化酶活性。一抗4 ℃溫育過夜，PBS漂洗，PV9000室溫溫育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸、75%乙醇分化，1%氨水返藍，過梯度乙醇脫水，封片。PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷

結(jié)果由濟寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院2位病理醫(yī)師分別獨立讀片。NFAT核、漿染色均計為陽性。免疫組化結(jié)果均根據(jù)細胞染色強度評分0、1、2、3和4；根據(jù)陽性細胞的百分數(shù)評分0(≤5%)、1(＞5%～25%)、2(＞25%～50%)、3(＞51%～75%)、4(＞75%～100%)。計算芯片上每個組織點染色強度和陽性細胞數(shù)評分的乘積；根據(jù)得分判斷0為陰性，≤4分為弱陽性，＞4分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。以χ2檢驗比較NFAT陽性組和陰性組之間的性別、年齡、飲酒史、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期的差異。對有差異的進行多因素Logistic回歸分析，確定獨立因素。所用統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NFAT蛋白各亞型在食管癌組織中的表達

全組組織芯片染色成功率100%，無脫片。圖1示NFAT蛋白染色陽性，定位于細胞質(zhì)或核內(nèi)。結(jié)果顯示：腫瘤組織中NFAT1～4表達陽性率分別為53.8%(56/104)，10.6%(11/104)，26.9%(28/104)，45.2%(47/104)；正常組織NFAT1～4表達陽性率27.9%(29/104)，1.9%(2/104)，11.5%(12/104)，20.2%(21/104，表2)。各亞型在食管鱗癌組織和癌旁食管組織中的表達均有顯著差異(P＜0.001)。

圖1 NFAT蛋白在食管鱗癌組織中的表達(IHC 200×)Fig. 1 The expression of NFAT proteins in ESCC tissues (IHC 200×)

表2 NFAT蛋白在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達情況Tab. 2 The expression of NFATs in ESCC tissues and adjacent normal tissues

2.2 食管癌組織中NFAT蛋白表達與臨床病理的關(guān)系

在104例食管鱗癌組織中，NFAT1蛋白表達率為53.8%(56/104)，與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度等臨床病理因素無相關(guān)性，但在有飲酒史者表達高于無飲酒史者(62.3% vs 37.1 %，P=0.01)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.002)及分期(P=0.02)有相關(guān)性，而Logistic回歸證實NFAT1過表達只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.031)。NFAT2蛋白表達與患者的年齡、性別、飲酒史、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床病理因素均未見相關(guān)性，但在Ⅰ、Ⅱ期患者中的NFAT2蛋白表達率(15.5%)高于Ⅲ期(4.3%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.07) (表3)。NFAT3蛋白表達僅在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(39.4%)與非轉(zhuǎn)移患者(19.7%)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)，而與患者的年齡、性別、飲酒史、腫瘤分化程度及臨床分期等臨床病理因素均無相關(guān)性。NFAT4蛋白表達在食管鱗癌組織中的表達率較高，為45.2%，但在各臨床病理因素間的表達未見明顯差異(表4)。

表3 NFAT1、NFAT2在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理因素之間的關(guān)系Tab. 3 Association between NFAT1 and NFAT2 expression and the clinicopathological features in ESCC

表4 NFAT3、NFAT4在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理因素之間的關(guān)系Tab. 4 Association between NFAT3 and NFAT4 expression and the clinicopathological features in ESCC

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子NFAT蛋白最初是在淋巴細胞分化和分化中被發(fā)現(xiàn)的，目前發(fā)現(xiàn)NFAT家族有5個成員，分別是NFAT1(又稱NFATp或NFATc2)、NFAT2 (又稱NFATc或NFATc1)、NFAT3(又稱NFATc4)、NFAT4(又稱NFATx或NFATc3)和NFAT5(TonE-BP［4］)。盡管被命名為NFAT，但它們不僅僅在T細胞中表達，在其他免疫細胞和非免疫細胞中也有表達。近年研究還發(fā)現(xiàn)NFAT蛋白在神經(jīng)細胞和中樞神經(jīng)組織［5］、內(nèi)皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、軟骨細胞、小腸細胞［6］、角化細胞和脂肪細胞等非免疫細胞和組織中也有不同程度的表達。NFAT以高度磷酸化無活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，通過刺激物激活磷脂酶Cγ，促使細胞內(nèi)Ca2+水平升高，激活CaN及其他鈣調(diào)素依賴的磷酸酶，使NFAT調(diào)節(jié)區(qū)的去磷酸化，原本被掩蓋的核定位序列(nuclear localization sequences，NLS)暴露出來并被受體識別，在其作用下轉(zhuǎn)運入核［7］，并與NFAT靶基因上的位點結(jié)合并共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。近年發(fā)現(xiàn)NFAT蛋白在細胞活化、分化及組織發(fā)育中有重要作用，可促進細胞惡性轉(zhuǎn)化，在胰腺、乳腺和結(jié)腸等多種腫瘤細胞和組織中表達增高，被認為是促癌因素［8-9］。

研究表明，在惡性黑素瘤細胞中，NFAT1被BRAF-MEK-ERK通路活化后可直接激活COX-2［10］。在子宮內(nèi)膜腺癌中，NFAT可介導(dǎo)前列腺素誘導(dǎo)的趨化因子CXCL8和細胞因子白介素11的表達［11］。以黑素瘤細胞接種NFAT1基因缺失的小鼠后發(fā)生肺內(nèi)腫瘤的機會要比野生型少［12］。從以上研究表明，NFAT基因通過其下游因子COX-2、某些趨化因子及細胞因子等為腫瘤的生長提供微環(huán)境，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用免疫組化的方法觀察NFAT各亞型在食管鱗癌及癌旁正常食管組織中的表達情況。結(jié)果顯示NFAT蛋白各亞型在食管鱗癌組織中的表達率均高于正常食管組織，這與既往其他腫瘤中的研究一致，表明NFAT蛋白在食管鱗癌中可能起一定作用。我們的研究還發(fā)現(xiàn)NFAT1與患者的飲酒史有關(guān)系，這可能說明NFAT1在腫瘤的發(fā)生階段起一定作用，NFAT1、NFAT2和NFAT3在腫瘤中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可能表明三者在腫瘤的發(fā)展過程中作用更大。

我們的研究還表明，各亞型在食管鱗癌組織中的表達情況不盡相同。NFAT1、NFAT4在食管鱗癌中的表達率較其他2種亞型為高，這表明各亞型在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起不同的作用。目前研究認為NFAT2作為癌基因促進細胞轉(zhuǎn)化，NFAT1在成纖維細胞、T淋巴細胞中誘導(dǎo)細胞周期阻滯促進細胞凋亡而起到抑癌基因的作用［13］。但有人在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NFAT1與WNT5A相互作用可以抑制細胞凋亡，使癌細胞出現(xiàn)化療藥耐受［14］。在SL3-3病毒誘導(dǎo)小鼠T淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，NFAT4基因缺失小鼠的淋巴瘤發(fā)生率明顯增加，潛伏期明顯縮短。該研究提示，NFAT4可能作為抑癌基因在起作用。在乳腺癌細胞中，NFAT1抑制依賴Stat5的基因表達，抑制腫瘤細胞的進展［15］。目前尚不清楚NFAT在什么情況下表現(xiàn)為抑癌基因。可能是不同的下游靶點決定了NFAT是促進生長還是分化，也可能是不同的細胞內(nèi)外環(huán)境決定。

NFAT作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一種重要的中間因子，調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程，共同參與促進腫瘤新生血管的形成。我們的結(jié)果表明，NFAT在食管鱗癌的形成和進展中可能起到一定作用。進一步探討NFAT在腫瘤中表達及其作用的靶基因有助于食管鱗癌生長行為特點的確定，NFAT有望成為食管鱗癌分子診斷中的1個重要的生物標志及其基因治療中的潛在靶點。

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Expression and clinical significance of NFAT isoforms in squamous cell carcinoma of esophagus

ZHAO Hong1, WANG Qi2, WANG Chang-hua1, ZHAO Shou-hua1
(1.Department of Thoracic Surgery, The Central People’s Hospital of Tengzhou City, Jining Medical College, Tengzhou Shandong 277500, China; 2.Department of Surgery, The Central Hospital of Zhou-ying Town, Zaozhuang Shandong 277000, China)

ZHAO Shou-hua E-mail: zsh75@163.com

Background and purpose: It was reported that nuclear factor of activated T cells (NFAT) is closely related with carcinomas. Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is one of the most common carcinomas in China. The present study investigated the expression and clinical significance of NFAT isoforms in ESCC. Methods: The expression of NFAT isoforms and the differences in different pathological levels of ESCC were detected in 104 specimens of human ESCC tissues and normal esophageal tissues by immunohistochemistry. Results: This study found that the positive rates of NFAT1 (53.8%), NFAT2 (10.6%), NFAT3 (26.9%), NFAT4 (45.2%) expression were significantly higher in tumor tissues than in adjacent normal esophageal tissues (P＜0.001), respectively. The positive rate of NFAT1 expression was significantly higher in drinkers (62.3%) than nondrinkers (37.1%, P=0.01), and also higher in patients with lymph node metastasis (68.4% vs 5.5%, P=0.002) and with late stage (58.7% vs 36.2%, P=0.02). Multivariate analysis showed that NFAT1 expression was correlated with lymph node metastasis. The positive rate of NFAT3 was significantly higher in patients with lymph node metastasis (39.4%) than in those without lymph node metastasis (19.7%, P=0.03). Conclusion: These results suggest that the overexpression of NFAT1 and NFAT3 is associated with lymph node metastasis in ESCC.

Esophagueal neoplasm; Nuclear factor of activated T cells; Metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.012

R735.1

A

1007-3639(2014)10-0783-06

2014-06-22

2014-08-26）

山東省自然科學(xué)基金資助項目(NO: ZR2010HL049)。

趙守華 E-mail:zsh75@163.com