賴曉娟，嚴小軍，楊銳，駱其君，陳海敏*

（1.寧波大學(xué)海洋生物工程重點實驗室，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，浙江寧波 315211）

高溫脅迫下壇紫菜的數(shù)字基因表達譜研究

賴曉娟1，嚴小軍1，楊銳1，駱其君1，陳海敏1*

（1.寧波大學(xué)海洋生物工程重點實驗室，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，浙江寧波 315211）

壇紫菜是潮間帶重要的經(jīng)濟藻種，對高溫、滲透壓等逆境具有獨特的調(diào)控機制。本文采用基于高通量測序的數(shù)字基因表達譜（DGE）技術(shù)研究了壇紫菜在高溫脅迫下的基因表達差異，并分析其相應(yīng)的響應(yīng)方式；利用實時定量PCR技術(shù)對DGE部分數(shù)據(jù)進行驗證；檢測了其中較有代表性的應(yīng)答基因hsp70的差異表達。結(jié)果顯示，高溫脅迫下壇紫菜中有256個unigene上調(diào)表達，以HSP、核糖體蛋白L12、延伸因子EF-Tu及部分光合作用相關(guān)基因為代表，3 820個unigene下調(diào)表達，主要為核酸、蛋白以及糖類等合成代謝相關(guān)基因。Gene Ontology分析表明，差異表達基因主要定位于質(zhì)體等有膜細胞器，參與繁殖和發(fā)育過程，行使催化和連接酶活性的功能。Pathway分析顯示，這些基因分布于107條pathway中。其中，下調(diào)表達基因最顯著富集于mRNA監(jiān)督和RNA轉(zhuǎn)運途徑，而上調(diào)表達基因部分富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、RNA降解及光合作用途徑。驗證表明此次DGE結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性，hsp70基因?qū)Ω邷仨憫?yīng)積極。綜上所述，DGE結(jié)果反應(yīng)出，在高溫脅迫時，壇紫菜出現(xiàn)基礎(chǔ)代謝減慢、合成速度下降、能量合成受阻、碳同化降低等現(xiàn)象，但光合作用前期未受影響，同時補救途徑啟動。

壇紫菜；高溫脅迫；數(shù)字基因表達譜（DGE）；差異表達基因；響應(yīng)

1 引言

壇紫菜Pyropia haitanensis屬于紅藻門Rhodophyta、原紅藻綱Protoflorideophyceae、紅毛藻目Bangiales、紅毛菜科Bangiaceae、紫菜屬Pyropia，為中國特有物種，主要分布于浙江、福建等南方海域，也是中國產(chǎn)量最高的紫菜養(yǎng)殖種類［1］。紫菜生長在沿海潮間帶，對高度多變的潮汐環(huán)境有著特殊的適應(yīng)性，尤其是對溫度、滲透壓及輻射等逆境具有高效的調(diào)節(jié)機制［2］。此外，紫菜在進化關(guān)系上比較原始，因此還可能擁有普通高等植物所沒有的獨特的抗逆機制。深入研究紫菜的抗逆機理將為紫菜以及陸地作物的健康栽培提供新思路。

過去幾年，基于傳統(tǒng)測序方法的表達序列標(biāo)簽（Express sequence tags，ESTs）技術(shù)在鑒定藻類抗逆相關(guān)基因及通路中取得了較多成果。近年來，隨著新一代測序平臺的發(fā)展以及市場化，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq）技術(shù)逐漸被應(yīng)用到藻類領(lǐng)域的研究，而基于此的數(shù)字基因表達譜（Digital Gene Expression Profiling，DGE）則因成本較低而多應(yīng)用于基因表達差異的研究［3］。目前對紫菜在高溫脅迫下的應(yīng)答機制研究還很少，而且多側(cè)重生理生化方面，楊銳等［2］曾提出壇紫菜對熱脅迫應(yīng)答的可能機制，但并未見后續(xù)詳細報道。最近，Choi等［4］通過轉(zhuǎn)錄組測序初步比較了甘紫菜Pyropia tenera在高溫和正常培養(yǎng)條件的表達差異，篩選出了部分應(yīng)答基因，但其中絕大多數(shù)為未知基因，也未進行深入分析。因此，我們對其調(diào)控機制的了解還十分有限，尤其缺少分子水平上的系統(tǒng)認識。本文使用DGE技術(shù)對壇紫菜在高溫脅迫下的基因表達差異進行研究，以期篩選相關(guān)的應(yīng)答基因并分析壇紫菜在高溫脅迫下的分子調(diào)控機制。

2 材料與方法

2.1 材料

壇紫菜葉狀體采自寧波象山壇紫菜養(yǎng)殖場，樣品在陰涼處風(fēng)干后保存于－20℃。

RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，實時定量PCR相關(guān)試劑PrimeScript○RRT reagentKit、SYBR○RPremix Ex TagTMⅡ購自TaKaRa公司。

2.2 方法

2.2.1 DGE文庫構(gòu)建和測序

實驗前用無菌海水將壇紫菜葉片清洗干凈，在L∶D＝12∶12、光強2 000～3 000 lx、20℃下復(fù)蘇培養(yǎng)24～48 h。高溫處理條件為35℃、30 min，取20℃下正常培養(yǎng)的樣品作為對照?？俁NA提取按照Trizol試劑說明書進行［5］，采用Agilent 2100檢測RNA質(zhì)量。之后用帶有Oligo（d T）的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer將mRNA打斷成平均長度為200 nt的短片段，以片段后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、d NTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，最后進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作［6］。采用HiSeq 2000∶42SE的策略進行測序，測序工作由深圳華大基因研究院完成。

2.2.2 DGE數(shù)據(jù)處理［6］

測序所得的原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)去接頭、去低質(zhì)量序列處理后得到高質(zhì)量干凈序列（clean reads）進行后續(xù)分析。使用短reads比對軟件SOAPaligner／soap2［7］將clean reads比對到參考基因序列。參考序列為本實驗室前期經(jīng)Illumina HiSeq 2000測序所獲得的壇紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（堿基總量3.1 Gb，組裝后Unigene數(shù)為27 887）?；虮磉_量的計算使用RP-KM法（reads perKb per million reads），參照Audic S. 和Claverie發(fā)表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法［8］篩選兩樣本間的差異表達基因，即FDR（False Discovery Rate）≤0.001且log2Ratio≥1（倍數(shù)差異不低于2倍）。后續(xù)分析均基于差異表達基因。Gene Ontology功能顯著性富集分析采用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（http：／／www.geneontology. org／）進行，將差異表達基因向數(shù)據(jù)庫的各term映射，計算每個term的基因數(shù)目。Pathway顯著性富集分析采用KEGG數(shù)據(jù)庫［9］，將差異表達基因向數(shù)據(jù)庫映射，統(tǒng)計各個pathway中基因數(shù)目及富集程度。

2.2.3 實時定量PCR驗證及hsp70基因的差異表達

取適量復(fù)蘇后的壇紫菜葉片置于35℃海水中，分別于放入后的0 min，5 min，15 min和30 min收集樣品，之后將剩余的壇紫菜葉片轉(zhuǎn)入正常20℃海水中恢復(fù)培養(yǎng)，并分別于15 min，30 min，60 min，120 min和180 min收集樣品，用吸水紙吸干表面水分，液氮速凍后存于－70℃冰箱待用（不超過12 h）。其中熱激處理0 min（對照）和30 min的點用來進行DGE數(shù)據(jù)的驗證。采用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行實時定量PCR檢測［10］。相關(guān)引物見表1，18S作為內(nèi)參。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃10 sec、55℃18 sec、72℃15 sec，40個循環(huán)。用Rotor-Gene的軟件進行CT值分析，采用2－ΔΔCT法計算差異表達水平。各實驗重復(fù)3次。

表1 實時定量PCR相關(guān)引物

續(xù)表1

3 結(jié)果

3.1 DGE測序數(shù)據(jù)評估

對照和高溫組這2個文庫經(jīng)HiSeq 2000高通量測序后分別得到9 212 191和9 678 860條clean reads，分別占raw reads的98.13%和97.59%，堿基總量分別為451.4 Mb和474.4 Mb，均有88%以上的序列能夠比對到參考序列（壇紫菜轉(zhuǎn)錄組），說明測序結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性，此外，測序飽和度分析顯示，2組文庫所檢測到的基因數(shù)都已趨于飽和（未呈現(xiàn)數(shù)據(jù)）。這為后續(xù)分析提供了良好基礎(chǔ)。

3.2 差異表達基因篩選

經(jīng)過嚴格篩選（FDR≤0.001且倍數(shù)差異不低于2倍），最后確定有256個unigene上調(diào)表達，3 820個unigene下調(diào)表達，即高溫處理后有14.62%的unigene出現(xiàn)了表達變化，其中上調(diào)和下調(diào)的比例分別為0.92%和13.70%，很明顯，壇紫菜在高溫脅迫下絕大多數(shù)基因出現(xiàn)了下調(diào)表達。

3.3 差異表達基因的功能分析

3.3.1 功能注釋

我們重點關(guān)注高溫脅迫下壇紫菜上調(diào)表達的基因。由于目前藻類基因組信息相對較少，這256個上調(diào)表達的unigene中大部分顯示沒有比對結(jié)果，其中只有59個有Nr比對結(jié)果，占總數(shù)的23.05%，所比對到的物種多為一些藻類，如條斑紫菜Pyropia yezoensis、萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii、長囊水云Ectocarpussiliculosus等，而這其中仍有近一半的unigene顯示為“predicted protein”或者“hypothetical protein”。選取其中有明確注釋信息的27個unigene列于表2中，可以看出，高溫脅迫下壇紫菜中上調(diào)表達的基因主要包括HSP70、小熱激蛋白、核糖體蛋白L12、延伸因子EF-Tu、高光誘導(dǎo)蛋白、光合作用相關(guān)蛋白以及其他參與代謝的一些酶類。

表2 高溫誘導(dǎo)或上調(diào)表達的基因

續(xù)表2

3.3.2 Gene Ontology功能顯著性富集分析

Gene Ontology功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因涉及核酸代謝、蛋白翻譯和修飾、糖代謝、脂質(zhì)代謝、有機酸代謝、萜類等的次級代謝、轉(zhuǎn)運、膜的組裝及響應(yīng)脅迫等生物過程。我們篩選在差異表達基因中顯著富集的GO term（corrected p≤0.05）列于表3中，可以看出，這些基因主要參與繁殖和發(fā)育過程，行使的功能主要是催化和連接酶活性，所處的細胞位置為質(zhì)體以及其他有膜細胞器，其中與催化活性相關(guān)的GO term富集的基因數(shù)量最多，其次為有膜細胞器，分別占到了差異表達基因總數(shù)的13.49%和9.30%，這些基因基本都呈現(xiàn)下調(diào)表達。

表3 差異表達基因的GO功能顯著性富集分析

3.3.3 Pathway顯著性富集分析

我們通過pathway富集分析來確定差異表達基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示，高溫脅迫下壇紫菜差異表達的基因分布在107條pathway中，圖1所示為unigene數(shù)量大于20的24條pathway，其中涉及代謝途徑的數(shù)量最多，占差異表達基因總數(shù)的9.25%。mRNA監(jiān)督和RNA轉(zhuǎn)運是2個顯著富集的pathway（Q≤0.05），分別富集了283和303個差異表達基因，占總數(shù)的6.94%和7.43%，而且基本都呈現(xiàn)下調(diào)表達。此外，次級代謝物合成、剪接體、氨酰-tRNA合成、甘油酯代謝、脂肪酸合成、碳同化等途徑也富集了大量下調(diào)表達的基因。如圖2所示，在碳同化途徑中，C3、C4途徑的大部分基因都有被找到，而且出現(xiàn)下調(diào)表達，其中C4途徑更為明顯。在光合作用途徑中，編碼PSⅡ反應(yīng)中心D1蛋白的psbA基因以及編碼細胞色素b6f復(fù)合體亞基IV 的petD基因出現(xiàn)上調(diào)表達，但編碼ATP合酶的部分相關(guān)基因呈現(xiàn)下調(diào)表達。RNA降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工這兩條途徑中有部分基因呈現(xiàn)上調(diào)表達，比較明顯的是HSP70以及小熱激蛋白。

圖1 差異表達基因的pathway分布

圖2 碳同化途徑相關(guān)基因的表達變化

3.4 實時定量PCR驗證

隨機選取了8個差異表達基因（其中4個上調(diào)，4個下調(diào)）進行實時定量PCR驗證（見圖3），結(jié)果顯示其中7個基因的表達趨勢與DGE結(jié)果一致。有1個相反（unigene16552），這個基因在DGE中為下調(diào)表達，但在此次驗證結(jié)果中顯示上調(diào)表達2.5倍。但總體說明此次DGE結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

3.5 高溫脅迫下hsp70基因的差異表達

選取DGE結(jié)果中比較有代表性的應(yīng)答基因hsp70（unigene15514），檢測了其在高溫脅迫下多個時間點的差異表達情況，如圖4所示，hsp70在高溫處理5 min后即出現(xiàn)上調(diào)表達，在30 min時達到最大，為對照的14.60倍；進入恢復(fù)培養(yǎng)15 min時，hsp70表達先有所下降，之后開始上升，并在60 min時達到峰值，為對照的15.31倍，然后又逐漸下降，在180 min降為對照的7.48倍，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而且整個恢復(fù)培養(yǎng)過程hsp70都保持較高水平的表達。

圖3 差異表達基因的實時定量PCR驗證

圖4 壇紫菜hsp70基因在高溫脅迫下的差異表達

4 討論

據(jù)筆者了解，這是首次利用基于高通量測序的DGE技術(shù)系統(tǒng)研究壇紫菜在高溫脅迫下的分子響應(yīng)機制。通過差異表達基因篩選以及功能注釋，我們發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下壇紫菜中僅有少部分基因出現(xiàn)上調(diào)表達，其中以HSP家族、核糖體蛋白L12、延伸因子EFTu及部分光合作用相關(guān)蛋白為代表，而有較高比例的基因呈現(xiàn)下調(diào)表達。Gene Ontology功能富集分析結(jié)果提示，壇紫菜在高溫脅迫下可能出現(xiàn)相關(guān)酶的催化活性減弱，如核酸合成、蛋白合成、糖類合成等初級代謝以及生物堿合成等次級代謝相關(guān)的酶類，而且發(fā)育和繁殖的生物過程開始減慢，并有可能導(dǎo)致質(zhì)體、線粒體等有膜細胞器的損傷。Pathway分析顯示，mRNA監(jiān)督和RNA轉(zhuǎn)運途徑明顯受到影響，而RNA降解途徑的基因開始上調(diào)表達，這可能導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生錯誤的蛋白產(chǎn)物以及蛋白合成受阻，進而導(dǎo)致細胞功能受損，而脂肪酸合成代謝途徑等相關(guān)基因的下調(diào)表達可能與細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷有關(guān)。

高等植物對高溫脅迫的響應(yīng)主要有蛋白合成速度減慢并伴隨HSP等應(yīng)答基因的上調(diào)表達［11—12］，這些在本研究中都有發(fā)現(xiàn)。此外，光合作用被認為是對高溫脅迫響應(yīng)最為敏感的途徑之一，主要表現(xiàn)為PSⅡ、碳同化及ATP的合成顯著受影響［13］，但本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下壇紫菜參與光合作用的兩個重要基因psbA和petD出現(xiàn)上調(diào)表達，而其中參與光合磷酸化的ATP合酶基因以及后續(xù)的碳同化途徑相關(guān)基因出現(xiàn)表達下調(diào)，說明ATP合成以及碳同化確實受到了抑制，但前期的光捕獲以及電子傳遞等并未受到影響，甚至出現(xiàn)上調(diào)的應(yīng)答反應(yīng)。綜合來說，壇紫菜在高溫脅迫下可能出現(xiàn)核酸、蛋白、糖類以及脂類等合成速度的全面減慢，其中以蛋白合成受抑制最為明顯，進而導(dǎo)致繁殖和發(fā)育過程變慢甚至出現(xiàn)細胞膜以及質(zhì)體、線粒體等細胞器受損，但它也擁有極強的抗高溫能力，同時會迅速啟動一系列的補救途徑，如HSP、psbA、pet D以及核糖體蛋白L12、延伸因子EFTu等的上調(diào)表達將為后期的恢復(fù)做準(zhǔn)備。

熱激蛋白（HSP）是一組廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守的蛋白家族，其中以HSP70最為保守和重要，參與新生肽的成熟以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性、降解，具有保護功能，也是高等植物中研究最為深入的脅迫應(yīng)答基因［14—15］。為深入研究壇紫菜hsp70基因的功能，本文還檢測了其在高溫脅迫下多個時間點的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)hsp70對高溫脅迫的響應(yīng)非常迅速，短時間的處理即可使其表達量明顯升高，在解除脅迫進入正常培養(yǎng)后，壇紫菜hsp70基因仍保持高水平表達，推測其可能參與后期的損傷修復(fù)過程，這與楊銳［2］等人的研究結(jié)果相似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)hsp70基因在剛進入恢復(fù)15 min時出現(xiàn)了短暫的下調(diào)，說明壇紫菜可能快速的感受到外界環(huán)境的改善，細胞出現(xiàn)hsp70基因暫時下調(diào)的反應(yīng)，但當(dāng)發(fā)現(xiàn)損傷還未修復(fù)，細胞仍需要合成大量的蛋白以進行后期恢復(fù)時，hsp70基因又開始上調(diào)。

Choi等人對列紫菜Pyropia seriata以及甘紫菜Pyropia tenera的在高溫脅迫下的差異表達進行了研究，也發(fā)現(xiàn)HSP家族是其中最有代表性的應(yīng)答基因，還指出核糖體蛋白L17a上調(diào)明顯［4，16］，而本研究的結(jié)果顯示核糖體蛋白L12為上調(diào)應(yīng)答基因，有一定差異，但核糖體蛋白參與高溫響應(yīng)早有報道，它有防止蛋白合成受抑制以及mRNA-rRNA加工和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能［17—18］。在植物小麥中，質(zhì)體的延伸因子EF-Tu是除HSP基因以外第二個被發(fā)現(xiàn)的具有提高植物耐熱能力的基因，它具有減少蛋白變性以及增強碳同化作用的功能［19］。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)了一個EF-Tu上調(diào)表達基因，但其屬于線粒體型，這與小麥不同，推測壇紫菜中線粒體的EF-Tu也可能具有類似功能，是一個重要的高溫應(yīng)答基因。

在高等植物的熱脅迫響應(yīng)研究中，目前只有HSP及熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）研究的比較透徹，雖然也通過各種組學(xué)技術(shù)篩選出了大量的熱脅迫相關(guān)基因、蛋白以及代謝物，但都還沒有進行深入研究［20—21］。Qin等［22］通過微陣列技術(shù)研究了小麥在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化，篩選到了其他一些上調(diào)基因，主要涉及激素合成、鈣離子及糖、脂質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及初級、次級代謝等。這些在本研究中并沒有找到太多信息，推測這可能與高溫處理的方式及物種特異性有關(guān)。壇紫菜在高溫脅迫下上調(diào)表達的基因數(shù)目較少，提示這部分基因可能對其耐高溫具有重要作用。由于目前紫菜基因組信息的限制，我們篩選到的差異表達基因中有非常高比例的序列沒有注釋結(jié)果，因為紫菜比較原始，其序列與其他生物同源性普遍較低，這也給功能注釋帶來了困難，但同時也提示，紫菜中的這些功能未知的差異表達基因可能正是其獨有的脅迫應(yīng)答基因，這部分基因行使著普通高等植物所不具有的功能，對其特殊的環(huán)境適應(yīng)性起著關(guān)鍵作用，如Kim等［16］人將篩選到的一個未知基因轉(zhuǎn)到萊茵衣藻中進行表達研究，證實具有抗高溫的功能。將來的工作是研究這些獨特基因的功能，以深入了解其調(diào)控機制并更好的利用這些基因資源。

綜上所述，在高溫脅迫時，壇紫菜出現(xiàn)基礎(chǔ)代謝減慢，核酸、蛋白、糖類等合成速度下降以及能量合成受阻、碳同化降低等現(xiàn)象，甚至可能導(dǎo)致繁殖和發(fā)育過程變慢以及膜、質(zhì)體等受傷害，但光合作用前期未受影響，同時HSP等修復(fù)蛋白表達增加，啟動補救途徑。

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Digital gene expression profiling analysis of Pyropia haitanensis （Rhodophyta）under high temperature stress

Lai Xiaojuan1，Yan Xiaojun1，Yang Rui1，Luo Qijun1，Chen Haimin1
（1.Marine Biotechnology Laboratory，Key Laboratory of AppliedMarine Biotechnology，Ministry of Educaltion，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

Pyropia haitanensis is an economically important red alga cultivated in China.As an intertidal alga，P．haitanensis developed various and highly effective strategies to overcome those environmental stressors，such as temperature fluctuation and osmotic shock.In this research，digital gene expression profiling（DGE）technique based on high throughput sequencing was used to analysis the gene expression difference of P．haitanensis under high temperature stress.To validate the DGE data，eight genes were selected for real-time quantitative PCR（QRTPCR）analysis.The expression level of high-temperature response gene hsp70 was particularly investigated.Results indicated that 256 unigenes including HSP，ribosomal protein L12，elongation factor EF-Tu and some photosynthesis-related genes were up-regulated，3 820 unigenes involved in anabolism and metabolism of nucleic acid，protein and carbohydrate were down-regulated.Gene Ontology analysis indicated that differentially expressed genes mainly involved in reproduction and developmental process，exercised the functions of catalytic activity and ligase activity，and located in membrane-bounded organelle such as plastid.Pathway enrichment analysis showed that these genes distributed in 107 pathways.Down-regulated genes were significantly enriched in mRNA surveillance and RNA transport pathway，while up-regulated genes were partially enriched in protein processing in endoplasmic reticulum，RNA degradation and photosynthesis pathway.QRT-PCR confirmed the accuracy of DGE，and the positive response of hsp70 to high temperature was also demonstrated.In summary，DGE results indicated that under high temperature stress，primary metabolism，biosynthesis，energy synthesis，and carbon assimilation of P．haitanensis were weakened，whereas，the rescue strategies were activated.

Pyropia haitanensis；high temperature stress；digital gene expression profiling（DGE）；differentially expressed gene；response

S917.3

A

0253-4193（2014）06-0104-08

2013-06-05；

2013-10-11。

浙江省重大科技專項（2012C12907－6）；國家公益性行業(yè)（海洋）科研專項經(jīng)費項目（201105023）；浙江省創(chuàng)新團隊項目（2012R10025－07）；寧波市創(chuàng)新團隊項目（2011B81007）；寧波市科技攻關(guān)項目（201201C1011016）；寧波大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項目。

賴曉娟（1989—），女，浙江省臺州市人，研究方向為海洋生物。E-mail：laixiaojuan204＠gmail.com

*通信作者：陳海敏，研究員，研究方向為海洋生物。E-mail：chenhaimin＠nbu.edu.cn

賴曉娟，嚴小軍，楊銳，等.高溫脅迫下壇紫菜的數(shù)字基因表達譜研究［J］.海洋學(xué)報，2014，36（6）：104—111，

10.3969／j.issn. 0253-4193.2014.06.013

Lai Xiaojuan，Yan Xiaojun，Yang Rui，et al.Digital gene expression profiling analysis of Pyropia haitanensis（Rhodophyta）under high temperature stress［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（6）：104—111，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.013