周 彬，周迎莉，林為民，石 鵬，付 宇，曹家月

(1.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安710054;2.解放軍第323醫(yī)院，陜西 西安710054)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種全身性的自身免疫性疾病，與遺傳、感染、環(huán)境、激素等因素相關(guān)，對于其確切病因至今不明。此病在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“痹證”的范疇。RA患者主要表現(xiàn)出慢性進行性關(guān)節(jié)病變，并以非化膿性、增生性滑膜炎，局部關(guān)節(jié)反復(fù)發(fā)作為特點，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，最后以關(guān)節(jié)功能損失而致殘。在病變發(fā)展過程中，RA患者還常見有骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)破壞。青藤堿(SN)是由防己科植物青風(fēng)藤及毛青藤的藤莖中提取的生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、免疫抑制等藥理作用。臨床實踐證明SN具有治療RA的作用[1]，但具體機制仍未明確。本研究利用SN聯(lián)合甲氨蝶呤(MTX)治療RA患者，觀察SN對RA患者外周血IL－1、IL－17和TNF－α表達水平的影響，為闡明相關(guān)機制提供參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2011年8月—2013年3月于解放軍第451醫(yī)院就診的RA患者60例，診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會RA的分類標(biāo)準，均為初治者，確診前均未用激素及免疫抑制劑等藥物，無合并其他系統(tǒng)性疾病。將患者隨機分為 2組:治療組30例，男12例，女18例;年齡22～63歲，平均42.5歲;病程(38.4±24.6)個月。對照組 30 例，男 11 例，女19例;年齡24～65 歲，平均 43.1 歲;病程(37.2±21.3)個月。 2組患者的性別、年齡、病程以及治療前的關(guān)節(jié)腫脹個數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛個數(shù)、晨僵時間、握力大小、患者評價、醫(yī)生評價、DAS28評分等基本資料比較均無顯著性差異(P均＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 對照組給予甲氨蝶呤(甲氨蝶呤片，上海信誼)10 mg口服，每周1次，連用8周;治療組在甲氨蝶呤口服治療基礎(chǔ)上服用青藤堿(商品名:正清風(fēng)痛寧，湖南華納大藥廠有限公司)60 mg/次，2次/d，連用8周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 RA活動性評價 用DAS28指數(shù)評價活動度。

1.3.2 臨床檢查指標(biāo) 患者于治療前和治療8周后各進行1次體檢，并記錄患者關(guān)節(jié)腫脹個數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛個數(shù)、晨僵時間、握力大小、患者評價、醫(yī)生評價、DAS28評分，同時進行紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)等檢查。

1.3.3 淋巴細胞的分離 無菌采取服藥治療前RA患者6～8 mL肝素抗凝靜脈血，1000 r/min離心5 min，收集血細胞，去血漿后的血細胞用生理鹽水重懸，用淋巴細胞分離液密度梯度(2100 r/min，離心25 min)離心，用移液器緩慢吸取白霧狀淋巴細胞層，并將淋巴細胞集中于10 mL離心管中備用。

1.3.4 qRT－PCR分析 利用RNA－Solve Reagent試劑盒提取淋巴細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA。定量分析合成引物序列，IL－1 P1:GATCCACACTCTCCAGCTGCA;P2:CAA CCAACAAGTGATATTCTCCATG;IL－17 P3:ACTCCTGGGAAGACCTCATTG;P4:GGCCACATGGTGGACAATCG;TNF－α P5:GGTCCCCAAAGGGATGAGAAGTTC;P6:CCACTTGGTGGTTTGCTACGACG;β－actin P7:TGGCACCACACCTTCTACAA;P8:TCGTCATACTCCTGCTTGCT。采用 DNA Engine Opticon-TM2熒光檢測系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR試劑盒進行基因表達的測定。反應(yīng)條件為:UNG酶50℃孵育2min，94℃預(yù)變性10 min。94℃ DNA變性20 s，引物在50℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)，72℃后延伸10 min。取3次重復(fù)的平均值，用目的基因的拷貝數(shù)除以β－actin的拷貝數(shù)作為靶基因的相對表達量。

1.4 療效評定標(biāo)準 2組各項臨床指標(biāo)的比較采用改善值(治療前值 －治療后值)和改善率(改善值/治療前值 ×100%)，將各項臨床指標(biāo)改善率相加求平均值，以平均改善率進行療效評價。顯效:平均改善率＞75%;有效:平均改善率30%～75%;無效:平均改善率＜30%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，2組均數(shù)間比較采用t檢驗，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析和兩兩比較(LSD)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組療效比較 見表1。

表1 2組治療后療效比較 例

2.2 2組治療前后主要體征與患者、醫(yī)生評價比較 治療后，2組患者各項臨床指標(biāo)都得到顯著改善(P均＜0.05)，且治療組較對照組改善更明顯(P均＜0.05)。見表2。

表2 2組治療前后主要癥狀及體征變化(±s)

表2 2組治療前后主要癥狀及體征變化(±s)

注:①與治療前比較，P ＜0.05;②與對照組治療后比較，P ＜0.05;1 mmHg=0.133 kPa。

組別 n 時間 晨僵時間/min 握力/mmHg 關(guān)節(jié)腫脹數(shù)/個 關(guān)節(jié)壓痛數(shù)/個 患者評價/分 醫(yī)生評價/分對照組 30 治療前治療后121.23 ±10.0363.27 ±8.07①78.33 ±8.6198.66 ±7.46①14.11 ±2.126.78 ±1.83①13.25 ±3.237.15 ±2.04①6.82±1.984.27 ±1.03①6.77 ±1.874.31 ±1.35①治療組 30 治療前治療后131.23 ±10.7941.27 ±7.27①②72.43 ±7.55113.66 ±6.48①②13.09 ±2.544.63 ±1.65①②14.35 ±2.835.44 ±1.94①②6.71 ±1.863.18 ±1.12①②6.47 ±1.983.01 ±1.23①②

2.3 2組治療前后各項實驗室檢查指標(biāo)比較 2組治療后DAS28、ESR、RF、CRP均有顯著改善，且治療組改善程度更明顯，2組患者治療后外周血淋巴細胞中IL－1，IL－17和TNF－α的表達下調(diào)(P＜0.05)，且治療組表達水平更低(P均 ＜0.05)。見表3。

表3 2組治療前后各項實驗室檢查指標(biāo)比較(±s)

表3 2組治療前后各項實驗室檢查指標(biāo)比較(±s)

注:①與治療前比較，P ＜0.05;②與對照組治療后比較，P ＜0.05。

組別 n 時間 DAS28評分/分 ESR/(mm/h) RF/(IU/mL) CRP/(mg/L) IL－1/(μg/L) IL－17/(μg/L)TNF－α/(μg/L)對照組 30 治療前治療后6.78 ±1.464.58 ±1.67①62.35 ±10.1428.78 ±9.87①130.22±12.1547.09 ±10.35①34.23 ±6.5415.89 ±4.33①10.23 ±0.393.40 ±0.41①11.33 ±0.425.62±0.27①16.27 ±0.577.44 ±0.31①治療組 30 治療前治療后6.72±1.723.49 ±1.43①②65.48 ±11.0517.58 ±8.97①②127.68 ±13.7631.28 ±11.06①②32.34 ±6.458.27 ±2.56①②9.87 ±0.361.82±0.29①②12.13 ±0.343.84 ±0.26①②16.81 ±0.465.89 ±0.26①②

3 討論

目前治療RA的主要方式包括非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、自體干細胞移植和基因治療等[2－4]。這些方式主要通過調(diào)節(jié)機體免疫以達到減緩病情發(fā)展的目的。但各種西藥治療只能治標(biāo)而無法根除病癥，長期服用也易使患者產(chǎn)生依賴性和毒副作用。生物免疫抑制劑如細胞因子抗體具有明確的療效，但由于其較大的毒副作用以及昂貴的醫(yī)療價格等特點限制了在臨床上的應(yīng)用。因此研究治療效果好、治療成本低、毒副作用小的傳統(tǒng)中藥如青藤堿具有重要的現(xiàn)實意義。

ESR、CRP、RF是3個常用的RA臨床檢測指標(biāo)，三者在評估RA患者病情狀況中有重要作用[5]。有研究者認為在RA疾病活動指標(biāo)的評價中，DAS28評分的敏感性和特異性要比CRP、ESR、RF好，且DAS28評分與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)增高及 Th17細胞降低具有明顯的相關(guān)性[6]。本研究結(jié)果也證明了青藤堿聯(lián)合甲氨蝶呤治療能夠改善RA患者中ESR、CRP、RF、DAS28評分等幾項臨床指標(biāo)，與周潔如等[6]研究相符。

研究顯示細胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA的發(fā)病機制中起到重要作用，患者外周血血清和關(guān)節(jié)滑膜及滑液中顯著增高的促炎因子如IL－1、TNF－α等是RA病變持續(xù)存在遷延進展的關(guān)鍵[7]。IL－1主要在單核巨噬細胞中合成分泌，也可由內(nèi)皮細胞、B細胞和活化的T細胞表達生成。IL－1具有促進滑膜細胞和淋巴細胞增殖和分化的能力，同時能促進滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放前列腺素E2和膠原酶。IL－17是RA發(fā)病早期炎癥因子，由Th17細胞產(chǎn)生，具有很強促炎癥作用。IL－17可以上調(diào)軟骨細胞及滑膜成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達，增強聚合素酶和膠原酶活性[8]。研究發(fā)現(xiàn)IL－1與IL－17之間具有相互促進與相互減弱的交叉調(diào)控作用[9]。TNF－α主要由單核巨噬細胞合成，T細胞、B細胞和成纖維細胞也可以合成一部分。TNF－α也具有許多與IL－1相似的作用，引起骨和軟骨的吸收破壞，促進成纖維母細胞的增生[10]。本研究顯示青藤堿聯(lián)合甲氨蝶呤治療能夠顯著降低RA患者外周血淋巴細胞IL－1、IL－17和TNF－α的表達，且其降低程度要明顯大于單獨使用甲氨蝶呤治療組，說明青藤堿可以通過調(diào)節(jié)淋巴細胞中相關(guān)細胞因子的表達進而調(diào)節(jié)免疫來治療RA。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿的可能作用機制包括:調(diào)控淋巴細胞的免疫功能，抑制炎癥反應(yīng);抑制病患處細胞如纖維樣滑膜細胞炎性因子的釋放;抑制滑膜細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，青藤堿聯(lián)合甲氨蝶呤可以有效改善RA患者的臨床癥狀，并且可以顯著降低患者外周血淋巴細胞表達IL－1、IL－17和TNF－α mRNA，顯示出青藤堿具有對外周血淋巴細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。免疫調(diào)節(jié)是一種多種細胞和因子參與的復(fù)雜過程，因此青藤堿參與免疫調(diào)節(jié)的具體機制還需進一步探討。

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