李海群

(河北省承德縣醫(yī)院，河北 承德 067400)

塞來昔布對大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB表達的影響

李海群

(河北省承德縣醫(yī)院，河北 承德 067400)

目的 研究塞來昔布對大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達的影響。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分為對照組、骨關(guān)節(jié)炎組(OA組)和塞來昔布治療組，每組10只。利用膝關(guān)節(jié)注射4%的木瓜蛋白酶溶液的方法制作骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后8周，采用關(guān)節(jié)炎評分法評定各組大鼠平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)(MAI)，Western blot方法檢測關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB蛋白的表達情況，RT-PCR方法檢測關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB mRNA的表達情況。結(jié)果 對照組關(guān)節(jié)無任何異常變化；OA組隨著造模時間的延長，關(guān)節(jié)出現(xiàn)了重度紅腫現(xiàn)象；與OA組比較，塞來昔布治療組的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)消退現(xiàn)象。術(shù)后8周，NF-κB蛋白及mRNA在對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨僅有微量表達，而在OA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表達則顯著升高(P<0.01)；與OA組相比，塞來昔布治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB蛋白及mRNA表達均顯著降低(P均<0.01)。結(jié)論 塞來昔布可通過下調(diào)NF-κB的表達來減輕骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

骨關(guān)節(jié)炎；塞來昔布；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；大鼠

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是中老人群常見的一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其主要病理特點是關(guān)節(jié)軟骨進行性變性、破壞、軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生、骨贅形成，同時伴有不同程度的滑膜炎癥，臨床表現(xiàn)主要為緩慢進展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、腫大伴活動受限，嚴(yán)重者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾[1-2]。塞來昔布是一種新一代的化合物，其可通過抑制環(huán)氧化酶-2(COX-2)阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生，達到抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱作用。本研究利用膝關(guān)節(jié)注射4%的木瓜蛋白酶溶液的方法制作OA模型，研究塞來昔布對OA的治療作用，為塞來昔布在OA防治中的有益作用提供理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 試劑與儀器 塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司)，兔抗大鼠NF-κB、β-actin多克隆抗體(Santa-Cruz,CA)；羊抗兔IgG(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，美國Beckman coulter DU 800分光光度儀,Avantitm高速低溫冷凍離心機,美國BIO2RADGD 2000 凝膠掃描分析系統(tǒng)，高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)，Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件(Media Cybernetics公司)。

1.2 實驗動物分組及模型建立 選取健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量180～200 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)動物部，普通飼料喂養(yǎng)l周后，隨機分為對照組、OA組和塞來昔布治療組，每組10只。OA組與塞來昔布治療組大鼠雙膝關(guān)節(jié)注射4%的木瓜蛋白酶溶液0.15 mL，1次/3 d，連續(xù)3次。對照組每鼠雙膝關(guān)節(jié)注射生理鹽水0.15 mL。末次注射木瓜蛋白酶1周后開始以灌胃給藥的方式給藥，塞來昔布治療組給予塞來昔布4 mg/(kg·d)，對照組和OA組給予等體積的生理鹽水，均每天1次，連續(xù)8周。

1.3 動物觀察及平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)(MAI)的測定 采用關(guān)節(jié)炎評分法(0～4級)，0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：關(guān)節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)中度紅腫；3分：關(guān)節(jié)重度紅腫；4分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫且不能負重。每只動物的關(guān)節(jié)炎評價分數(shù)為四肢關(guān)節(jié)評價分數(shù)之和。

1.4 Western blot方法檢測關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB蛋白表達情況 動物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mL/100g)，取股骨髁表面的軟骨，剪碎，加入蛋白抽提液抽提蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)印、4 ℃封閉過夜，一抗NF-κB(1∶200)和β-actin(1∶400)室溫孵育2 h，TTBS洗滌10 min，3次，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TTBS洗滌10 min，3次，ECL顯影并掃描測光密度值。

1.5 RT-PCR方法檢測關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB mRNA表達情況 動物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mL/100 g)，取股骨髁表面的軟骨，剪碎，按RNAout說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄法(RT法)先合成cDNA，再進行PCR擴增；NF-κB上游引物序列為5′-CCTGCTTACGGGTGGGATTG-3′，下游引物序列為5′-GTTTCTTTCTCAGGGGGGATTC-3′，產(chǎn)物大小為152 bp，β-actin的上游引物為5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物為5′-GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，擴增產(chǎn)物全長374 bp。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行分析。用目的基因與β-actin光密度的比值代表目的基因的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 3組MAI比較 對照組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，無任何異常變化。OA組隨著造模時間的延長，關(guān)節(jié)出現(xiàn)了重度紅腫現(xiàn)象，同時伴隨著食欲降低、體質(zhì)量減輕及輕度脫毛等癥狀。與OA組比較，塞來昔布治療組的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)消退現(xiàn)象。見圖1。

圖1 各組大鼠MAI比較

2.2 3組NF-κB蛋白表達水平比較 NF-κB蛋白在對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨僅有微量表達；在OA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表達水平則顯著升高(P<0.01)；與OA組相比，塞來昔布治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。見圖2及圖3。

A為對照組;B為OA組;C為塞來昔布治療組

圖3 各組大鼠NF-κB蛋白表達的光密度值比較

2.3 3組NF-κB mRNA表達水平比較 NF-κB mRNA在對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨僅有微量表達；在OA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表達水平則顯著升高(P<0.01)；與OA組相比，塞來昔布治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4及圖5。

A為對照組;B為OA組;C為塞來昔布治療組

圖5 各組大鼠NF-κB mRNA的光密度值比較

3 討 論

OA是最常見的慢性退行性關(guān)節(jié)病損，又稱為退行性骨關(guān)節(jié)病、肥大性關(guān)節(jié)病和老年性骨關(guān)節(jié)病。OA的病變特點為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷、破壞，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，骨贅形成等。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)OA的發(fā)病率為3.0%～8.3%[3]，55～64歲人群中發(fā)病率達40%[4]，但是當(dāng)前對OA具體的發(fā)病機制仍不十分清楚，臨床上也無治愈OA的可靠方法。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，在不同的細胞進程如炎癥、免疫反應(yīng)、分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮中心調(diào)控作用[5]。在機體多種細胞因子合成過程中，NF-κB能在轉(zhuǎn)錄水平上對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，正常情況下NF-κB與Iκb結(jié)合后存在于胞漿中，不表現(xiàn)活性；當(dāng)接受到激活信息后，Iκb被磷酸化，從而釋出NF-κB，此時NF-κB則處于活化狀態(tài)?；罨蟮腘F-κB可進入細胞核與DNA相應(yīng)位點結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)炎性因子及其他細胞因子合成。有研究已證實，NF-κB具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在炎癥調(diào)節(jié)方面具有重要作用，是炎癥反應(yīng)復(fù)雜細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要環(huán)節(jié)。其對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起主要調(diào)節(jié)作用，如NF-κB可引起腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)轉(zhuǎn)錄水平增強，使上述2種細胞因子分泌增多[6]。動物實驗研究表明，在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進程中，NF-κB的激活要優(yōu)先于關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)，在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，NF-κB的表達與MMP-13 (Matrix Metallo Proteinases-13)的表達相耦聯(lián)[7]；在藥物誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，炎癥滑膜表層和血管翳周圍存在激活型NF-κB p65水平的提高，注射藥物側(cè)表達程度大于非注射側(cè)[8]，而且非甾體類抗炎藥(NSAIDs)如阿司匹林、布洛芬、舒林酸等治療OA的許多臨床常用藥物具有抑制NF-κB活性的作用，通過抑制IKK的活性，防止IκB磷酸化，從而阻止NF-κB通路的激活[9]。

環(huán)氧合酶有COX-1、COX-2及COX-3 3個亞型，其中COX-2呈誘導(dǎo)性表達，又稱炎癥性COX，主要位于核膜，生理狀態(tài)下大多數(shù)組織不表達，在受到細菌脂多糖(LPS)、炎癥細胞因子等刺激時誘發(fā)性的高表達，從而引起炎癥組織中的PGE2、PGI2和PGE1的含量升高，產(chǎn)生紅腫熱痛[10]。有研究證明，COX-2亦可通過調(diào)節(jié)破骨細胞分化因子的表達，參與破骨細胞的形成，并引導(dǎo)干細胞向脂肪系細胞分化，而不是向成骨系細胞分化而發(fā)揮作用[11]。特異性COX-2抑制劑對OA的軟骨有保護和促進修復(fù)作用，兼有抗炎與保護軟骨雙重療效[12]，但是，COX-2抑制劑在OA中的具體作用機制尚不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給予塞來昔布處理后，OA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)消退現(xiàn)象，NF-κB蛋白在對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨僅有微量表達，而在OA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表達則顯著升高；與OA組相比，塞來昔布治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB蛋白表達顯著降低。提示塞來昔布很可能通過下調(diào)NF-κB表達來減輕OA的炎癥反應(yīng)，為塞來昔布在OA防治中的有益作用提供了理論依據(jù)。

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Effect of Celebrex on the expression of NF-κB in articular cartilage of osteoarthritic rat

Li Haiqun

(Chengde County Hospital, Chengde 067400, Hebei,China)

Objective It is to study the effect of Celebrex on the expression of NF-κB in articular cartilage of osteoarthritic rat model. Methods 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into control group, osteoarthritic (OA) group and celecoxib treatment groups, each group had 10 rats.The model of osteoarthritis was induced with injecting 4% papain solution into Knee joints. The mean arthritic index(MAI) was assessed,and the expressions of NF-κB protein and mRNA was detected by Western blot and RT-PCR methods respectively. Results There was no any abnormal changes in joint of rats in control group, however, swelling began to appear in joint of rats in OA model group with time sustained; compared with OA model group, the phenomenon of swelling began to mitigate after celecoxib was gavage in joint of rats in Celecoxib treatment group.The expressions of NF-κB protein and mRNA was detected in joint of rats of all group in 8 weeks after surgery. There was minimal expressions of NF-κB protein and mRNA in joint of rats of control group, but increased significantly in joint of rats of OA group; compared with OA model group, the expressions of NF-κB protein and mRNA was lower in Celebrex group(P<0.01). Conclusion Celecoxib could relieve inflammatory actions of OA by down-regulating the expression of NF-κB.

osteoarthritis; Celecoxib; NF-κB; rat

李海群，男，主治醫(yī)師，從事骨科臨床工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.19.008

R-332

A

1008-8849(2014)19-2072-03

2013-12-01