馬紅武，劉會娟，朱年青，陳 濤

代謝工程方法改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)乙偶姻

馬紅武1,2，劉會娟1，朱年青1，陳 濤1

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

應(yīng)用代謝工程方法對Corynebacterium glutamicum ATCC 13032生物合成乙偶姻進(jìn)行了研究．在C. glutamicum ATCC 13032中導(dǎo)入了Bacillus subtilis 168的乙偶姻合成途徑的相關(guān)基因alsSD操縱子，工程菌株的乙偶姻產(chǎn)量為2.14,g/L．為了增加合成乙偶姻的直接前體物丙酮酸的供給，進(jìn)一步敲除了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1亞基的編碼基因(aceE)和乳酸脫氫酶基因(ldhA)，工程菌株的乙偶姻產(chǎn)量提高到5.09,g/L．最后，敲除了工程菌株的2，3-丁二醇脫氫酶基因(butA)以阻斷副產(chǎn)物2，3-丁二醇的合成，在優(yōu)化的溶氧條件下，菌株CGL3在基本培養(yǎng)基中乙偶姻產(chǎn)量提高到8.33,g/L，達(dá)到理論得率的51.5%．實(shí)驗結(jié)果表明經(jīng)過代謝工程改造的C. glutamicum ATCC 13032具有良好的乙偶姻合成能力和應(yīng)用潛力．

代謝工程；乙偶姻；谷氨酸棒狀桿菌；乙酰乳酸合成酶；乙酰乳酸脫羧酶

乙偶姻，又名3-羥基-2-丁酮，作為一種重要的高附加值化合物，在食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)都有重要用途，美國能源部曾將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的化合物之一．

自然界中多種微生物能夠生產(chǎn)乙偶姻，研究較多的是克雷伯氏菌屬(Klebisella)、腸桿菌屬(Enterobacter)等[1]．由于這些菌種屬于病原菌或條件病原菌，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用有一定風(fēng)險，而谷氨酸棒狀桿菌是氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的安全性革蘭氏陽性菌[2]．傳統(tǒng)的育種方式主要是誘變育種，目前基因組改組技術(shù)和代謝工程方法在菌種選育領(lǐng)域受到高度重視[3]．

C. glutamicum ATCC 13032生長迅速，在有氧發(fā)酵培養(yǎng)時可以獲得較高菌體密度，底物消耗速率快，從而可以獲得較為理想的產(chǎn)物生產(chǎn)率．失活C. glutamicum ATCC 13032丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1亞基(aceE)[4]或敲除乳酸脫氫酶編碼基因(ldhA)[5]均能夠提高細(xì)胞積累丙酮酸的能力．合成乙偶姻的前體物是丙酮酸，所以谷氨酸棒狀桿菌比較適合作為生物合成乙偶姻的生產(chǎn)菌．

筆者通過代謝工程方法改造谷氨酸棒狀桿菌C. glutamicum ATCC 13032使其生產(chǎn)乙偶姻，首先在C. glutamicum ATCC 13032中表達(dá)B. subtilis 168乙偶姻合成途徑alsSD操縱子，得到乙偶姻生產(chǎn)菌株CGL1；進(jìn)而敲除丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1亞基基因和乳酸脫氫酶基因得到菌株CGL2，提高乙偶姻的碳源得率；進(jìn)一步失活乙偶姻消耗途徑，敲除2，3-丁二醇脫氫酶基因(butA)得到菌株CGL3；最終結(jié)合初步的培養(yǎng)條件研究，使得菌株CGL3在基本培養(yǎng)基中乙偶姻產(chǎn)量提高到8.33,g/L，達(dá)到理論得率的51.5%，論文結(jié)果有一定理論意義．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株和質(zhì)粒見表1．

表1 菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10,g/L，酵母粉5,g/L，氯化鈉10,g/L，pH 7.0，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中添加20,g/L的瓊脂粉，需要時添加25,μg/mL卡那霉素．

BHIS培養(yǎng)基：腦心浸粉37,g/L，山梨醇91,g/L．

CGIII培養(yǎng)基：蛋白胨10,g/L，酵母粉10,g/L，氯化鈉2.5,g/L．

CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO4(5,g/L)，尿素(5,g/L)，KH2PO4(1,g/L)，K2HPO4(1,g/L)，MgSO4· 7H2O(0.25,g/L)，CaCl2(10,mg/L)，F(xiàn)eSO4·7,H2O (10,mg/L)，MnSO4·H2O(0.1,mg/L)，ZnSO4·7,H2O (1,mg/L)，CuSO4·5,H2O(0.2,mg/L)，NiCl2·6,H2O (20,μg/L)，生物素(0.4,mg/L)，葡萄糖(33,g/L)．

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計

引物設(shè)計見表2．

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒和敲除質(zhì)粒構(gòu)建

表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：以B. subtilis 168基因組為模板，用引物alsD-U/alsD-D(引物alsD-U帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列AAAGGAGGACAACC)，通過PCR擴(kuò)增得到alsD片段，目的片段用限制性內(nèi)切酶BamH I和Pst I酶切連接到C. glutamicum ATCC 13032和大腸桿菌穿梭載體pEC-XK99E上得到pEC-XK99E-alsD．a(chǎn)lsS基因以引物alsS-U/alsS-D(引物alsS-U帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列AAAGGAGGACAACC)進(jìn)行擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶Sac I和BamH I酶切連接到pEC-XK99E-alsD上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在添加25,μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，通過驗證得到表達(dá)載體pEC-XK99E-alsSD．

敲除質(zhì)粒構(gòu)建：aceE基因上下游(大約500,bp)設(shè)計兩對引物aceE1/aceE2和aceE3/aceE4(見表2)，引物aceE2/aceE3之間有互補(bǔ)序列，可以實(shí)現(xiàn)兩片段融合PCR．以C. glutamicum ATCC 13032基因組為模板，用引物對aceE1/aceE2和aceE3/aceE4分別進(jìn)行片段擴(kuò)增；再以得到的PCR產(chǎn)物為模板，通過引物aceE1/aceE4進(jìn)行融合PCR，目的片段用限制性內(nèi)切酶Sal I和BamH I酶切連接到載體pDsacB質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在含有25,μg/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基上得到陽性轉(zhuǎn)化子aceE基因敲除質(zhì)粒pDsacB-ΔaceE．同理，ldhA與butA基因無痕敲除質(zhì)粒構(gòu)建同上．

表2 引物設(shè)計Tab.2 Primers design

敲除方法：aceE、ldhA和butA基因敲除參照Sch?feret方法[7]，通過同源重組將目的基因無痕敲除，在添加100,g/L蔗糖的CGIII培養(yǎng)基上篩選得到目的基因敲除菌株．對于aceE基因敲除菌株需要在培養(yǎng)基中添加10,g/L乙酸鈉．

1.2.3 重組菌株發(fā)酵

將C. glutamicum ATCC 13032菌株在BHIS平板上劃線活化，30,℃培養(yǎng)48,h；挑取單菌落于裝有5,mL BHIS培養(yǎng)基的試管中，30,℃，220,r/min過夜培養(yǎng)，取1,mL轉(zhuǎn)接CGIII培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)．當(dāng)菌體處于對數(shù)生長期時離心菌體(4,500g，10,min，4,℃)，倒掉上清，用0.9% NaCl溶液重懸菌體，接種到50,mL CGXII(500,mL搖瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，使初始OD600達(dá)到1左右，發(fā)酵條件為30,℃、120,r/min．

1.2.4 乙酰乳酸合成酶的酶活測定

與發(fā)酵培養(yǎng)條件相同：培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長期收集菌液50,mL，4,℃條件下，9,000,r/min離心10,min收集菌體；用2,mL的0.1,mol/L pH 7.0磷酸緩沖液(4,℃預(yù)冷)洗滌二次懸浮在2,mL同樣的緩沖液中；向懸浮液中加入終質(zhì)量濃度為1,mg/mL的溶菌酶，37,℃水浴1～2,h，進(jìn)一步用超聲波破碎菌體；4,℃條件下，9,000,r/min離心30,min去除菌體等雜質(zhì)，得上清即為粗酶液，放置冰上備用．蛋白濃度測定參照Yang等[8]方法，乙酰乳酸合成酶的比活力單位為：每分鐘每毫克蛋白生成1,mmol乙酰乳酸/乙偶姻所需的酶量．

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析

通過紫外可見分光光度計測定波長600,nm處的吸光度值記錄細(xì)胞生長．培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀(SBA-40,C)(山東省科學(xué)院生物研究所)檢測．乙偶姻和有機(jī)酸采用高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent公司1100色譜儀)檢測．色譜柱為Aminex HPX-87,H column．流動相為5,mmol/L H2SO4．色譜條件如下：柱溫65,℃，流速0.4,mL/min，紫外UVD和示差RID檢測器.

2 結(jié)果與討論

2.1 在C. glutamicum ATCC 13032中表達(dá)alsSD操縱子

微生物的乙偶姻合成途徑如圖1所示．糖類物質(zhì)經(jīng)糖酵解途徑合成丙酮酸，兩分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase，ALS)作用下生成α-乙酰乳酸和二氧化碳，α-乙酰乳酸經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate decarboxyase，ALDC)的作用生成乙偶姻．乙偶姻進(jìn)一步在2，3-丁二醇脫氫酶(2，3-butanediol dehydrogenase，BDH)的作用下生成2，3-丁二醇[9]．

Bacillus subtilis 168的乙偶姻合成途徑關(guān)鍵酶乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脫羧酶分別由alsSD操縱子的alsS和alsD編碼[10]．為了在C. glutamicum ATCC 13032中引入乙偶姻合成途徑，將表達(dá)質(zhì)粒pEC-XK99E-alsSD轉(zhuǎn)化到C. glutamicum ATCC 13032中，得到菌株CGL1．a(chǎn)lsSD操縱子的轉(zhuǎn)錄由強(qiáng)啟動子Ptrc控制，在0.5,mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)合成乙偶姻的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脫羧酶．

圖1 谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways in C. glutamicum ATCC 13032

首先從酶學(xué)特性考察菌株CGL1中乙酰乳酸合成酶表達(dá)效果，對C. glutamicum ATCC 13032和CGL1的ALS酶活進(jìn)行了測定．CGL1乙酰乳酸合成酶的比酶活為(46.1±0.74)U/(mg蛋白)，而對應(yīng)的野生型菌株僅為(2.5±0.26)U/(mg蛋白)，重組菌的比酶活提高了17倍．

為測定菌株CGL1生產(chǎn)乙偶姻的能力，對重組菌株CGL1和野生型菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗．菌株CGL1的發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，CGL1接種初始OD600為1左右，17,h時OD600達(dá)到20，比生長速率為0.149,h-1，發(fā)酵48,h消耗了33,g/L的葡萄糖，生產(chǎn)了2.14,g/L的乙偶姻．目標(biāo)產(chǎn)物乙偶姻得率達(dá)到理論得率的13.25%，生產(chǎn)率為0.044,g/(h·L)．相同條件下野生型菌株在整個發(fā)酵過程中未檢測到乙偶姻的生成．發(fā)酵結(jié)果表明alsSD操縱子在C. glutamicum ATCC 13032中成功表達(dá)．

圖2 CGL1發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation of CGL1

除了目標(biāo)產(chǎn)物乙偶姻，發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到大量的乳酸，乳酸的生成會競爭消耗合成乙偶姻的直接前體物丙酮酸．碳源大量流向乳酸合成途徑使乙偶姻前體物丙酮酸供給不足，導(dǎo)致乙偶姻得率較低．

2.2 aceE和ldhA基因敲除對菌株生產(chǎn)乙偶姻的影響

菌株CGL1發(fā)酵過程中生成大量乳酸，為了阻斷副產(chǎn)物乳酸的生成敲除ldhA基因．同時失活aceE基因增加乙偶姻前體物丙酮酸的供給，得到雙敲除菌株CGL2．當(dāng)以葡萄糖為底物時，aceE基因的失活導(dǎo)致丙酮酸代謝生成乙酰輔酶A的碳流被完全阻斷，會影響菌體生長．需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量乙酸鹽，乙酸鹽在乙酸激酶(AK)與磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)作用下生成乙酰輔酶A，維持正常的三羧酸循環(huán)，使菌體恢復(fù)正常生長[11]．所以本實(shí)驗中對于aceE基因敲除菌株在發(fā)酵時要在培養(yǎng)基中添加10,g/L乙酸鈉．

菌株CGL2的發(fā)酵結(jié)果如圖3所示．由圖可知，對數(shù)期的比生長速率為0.114,h-1，發(fā)酵31,h進(jìn)入穩(wěn)定期，最大OD600值保持在34左右．發(fā)酵36,h時，底物葡萄糖和乙酸鹽同時被耗盡．與菌株CGL1相比，菌株CGL2的比生長速率下降了24%，生長延滯期增長，最終菌體密度較高．最終乙偶姻的濃度為5.09,g/L，達(dá)到理論得率的31.54%，相對于菌株CGL1產(chǎn)量提高了1.38倍．發(fā)酵液中檢測不到乳酸的生成，表明敲除ldhA基因有效地阻斷了乳酸合成途徑．a(chǎn)ceE與ldhA基因的失活阻斷了與乙偶姻競爭利用丙酮酸的代謝途徑，代謝流在丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行重新分配，使得乙偶姻合成代謝流增加，乙偶姻產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率得到大幅度提高．

圖3 CGL2發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation of CGL2

菌株CGL2發(fā)酵過程中積累了5.35,g/L琥珀酸. Zimmermann等[12]發(fā)現(xiàn)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗中，菌體OD600大于10時會導(dǎo)致溶氧不足．C. glutamicum ATCC 13032在微好氧和厭氧發(fā)酵條件下，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的作用下生成草酰乙酸，經(jīng)過TCA還原臂生成琥珀酸[13].同時Inui等[14]研究表明，C. glutamicum ATCC 13032在厭氧條件下，敲除ldhA基因會提高琥珀酸產(chǎn)量.溶氧不足的條件下，敲除依賴于NADH的乳酸脫氫酶基因會造成還原力不平衡，過剩的還原力將會用于琥珀酸合成，維持NAD+/NADH平衡．所以菌株CGL2發(fā)酵過程積累琥珀酸主要是菌體濃度過高、溶氧不足造成的．

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中期會有微量的2，3-丁二醇生成(數(shù)據(jù)未顯示)，末期時2，3-丁二醇又被代謝利用．

2.3 butA基因敲除對生產(chǎn)乙偶姻的影響

菌株CGL2發(fā)酵過程中檢測到2，3-丁二醇的生成，表明C. glutamicum ATCC 13032的2，3-丁二醇脫氫酶(ButA)具有潛在酶活性．乙偶姻在ButA作用下經(jīng)過脫氫反應(yīng)生成2，3-丁二醇．為了減少乙偶姻代謝消耗，在菌株CGL2的基礎(chǔ)上敲除butA基因得到菌株CGL3，阻斷2，3-丁二醇的合成途徑．

菌株CGL3發(fā)酵結(jié)果如圖4所示．由圖可知，對數(shù)期的比生長速率為0.125,h-1，發(fā)酵24,h時進(jìn)入穩(wěn)定期，基因敲除對菌體生長速率幾乎沒有影響．發(fā)酵產(chǎn)物檢測最終乙偶姻的產(chǎn)量達(dá)到5.88,g/L，與CGL2相比，菌株CGL3乙偶姻產(chǎn)量提高了15.55%，乙偶姻生產(chǎn)率達(dá)到0.143,g/(h·L)．整個發(fā)酵過程中檢測不到2，3-丁二醇，表明敲除butA基因有效阻斷了2，3-丁二醇的合成途徑，同時提高了乙偶姻的產(chǎn)量．

圖4 CGL3發(fā)酵曲線Fig.4 Fermentation of CGL3

副產(chǎn)物琥珀酸的產(chǎn)量為4.33,g/L，下降了19%．菌株CGL3發(fā)酵過程中最大OD600保持在20左右，與CGL2相比菌體密度下降，溶氧條件得到改善，減少了琥珀酸的生成．

2.4 不同溶氧條件對菌株CGL3生產(chǎn)乙偶姻的影響發(fā)酵過程中很多參數(shù)會影響乙偶姻的生產(chǎn)，包括溶氧、pH和發(fā)酵方式等．其中溶氧是乙偶姻發(fā)酵生產(chǎn)的重要操作條件．溶氧過高，碳源主要用于菌體生長和生成CO2，造成碳源浪費(fèi)；溶氧較低則導(dǎo)致琥珀酸的生成．為了降低琥珀酸的積累，優(yōu)化發(fā)酵條件，探討了不同的搖床轉(zhuǎn)速對菌株CGL3發(fā)酵的影響．

如圖5所示，研究了120,r/min、150,r/min、180,r/min和220,r/min 4個轉(zhuǎn)速條件下菌株CGL3生產(chǎn)乙偶姻的狀況．實(shí)驗結(jié)果表明150,r/min為最佳轉(zhuǎn)速，在此條件下乙偶姻產(chǎn)量8.33,g/L，達(dá)到理論得率的51.5%．生產(chǎn)率為0.207,g/(h·L)，與120,r/min轉(zhuǎn)速條件下相比，生產(chǎn)率提高了40.37%．當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加時，乙偶姻的產(chǎn)量開始呈下降趨勢．所以通過優(yōu)化實(shí)驗，確定乙偶姻生產(chǎn)的最佳轉(zhuǎn)速為150,r/min．

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對生產(chǎn)乙偶姻的影響Fig.5 Effect of rotation speed on acetoin production

琥珀酸的生成量隨著轉(zhuǎn)速的增加呈下降趨勢，轉(zhuǎn)速為220,r/min時發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到有琥珀酸生成．溶氧直接影響菌體生長、代謝途徑和產(chǎn)物合成，完全好氧條件下，氧氣作為氫受體，可以有效維持NAD+/NADH平衡，抑制琥珀酸生成．但是完全好氧條件下，大量碳源用于菌體呼吸生成CO2，所以當(dāng)轉(zhuǎn)速高于150,r/min時乙偶姻產(chǎn)量有下降趨勢，造成碳源浪費(fèi)．

3 結(jié) 論

本研究首次構(gòu)建了生產(chǎn)乙偶姻的谷氨酸棒狀桿菌工程菌株．

(1) 在野生型C. glutamicum ATCC 13032中表達(dá)合成乙偶姻操縱子，菌種CGL1發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻2.14,g/L，同時積累大量副產(chǎn)物乳酸．

(2) 構(gòu)建ldhA和aceE基因敲除菌株CGL2，乙偶姻產(chǎn)量為5.09,g/L，有大量琥珀酸生成，同時檢測到有微量2，3-丁二醇生成．

(3) 敲除butA基因阻斷乙偶姻降解途徑，得到菌株CGL3，發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到2，3-丁二醇，菌體密度下降，減少了琥珀酸的積累，乙偶姻的產(chǎn)量達(dá)到5.88,g/L．

(4) 不同轉(zhuǎn)速條件下菌株CGL3發(fā)酵結(jié)果顯示，150,r/min為乙偶姻生產(chǎn)的最佳轉(zhuǎn)速．該條件下乙偶姻產(chǎn)量為8.33,g/L，達(dá)到理論得率的51.5%．

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（責(zé)任編輯：田 軍）

Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum for Acetoin Production

Ma Hongwu1,2，Liu Huijuan1，Zhu Nianqing1，Chen Tao1
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

The acetoin was synthesized using metabolic engineering method from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. The alsSD operon derived from Bacillus subtilis 168 was expressed in C. glutamicum ATCC 13032 to yield acetoin of 2.14,g/L in the engineering strain. Additional inactivation of aceE gene encoding the E1p enzyme of the pyruvate dehydrogenase complex and ldhA gene encoding NAD+-dependent L-lactate dehydrogenase increased the supply of acetoin precursor. The acetoin production increased to 5.09,g/L with the newly constructed strain. Subsequently，formation of 2，3-butanediol was inhibited by deleting butA gene encoding for 2，3-butanediol dehydrogenase. Total yield of acetoin reached 8.33,g/L(51.1% of theoretical yield)under the optimum fermentation condition in the strain CGL3. The experimental results show that the strain of C. glutamicum ATCC 13032,engineered metabolically can provide a potential application for acetoin synthesis.

metabolic engineering；acetoin；Corynebacterium glutamicum；acetolactate decarboxylase；acetolactate synthase

Q815

A

0493-2137(2014)11-0967-06

10.11784/tdxbz201304053

2013-04-27；

2013-06-04.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2011CBA00804，2012CB725203)；國家自然科學(xué)基金資助項目(21176182).

馬紅武（1970— ），男，博士，研究員，hongwu.ma@gmail.com.

陳 濤，chentao@tju.edu.cn.

時間：2014-04-08.

http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.11784/tdxbz201304053.html.