王桂苓，邢化冰，李琳琳，劉貝貝

(安徽省阜陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽(yáng) 236112)

光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中的黃曲霉毒素B1

王桂苓，邢化冰，李琳琳，劉貝貝

(安徽省阜陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽阜陽(yáng) 236112)

建立嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素B1的高效液相色譜熒光檢測(cè)器測(cè)定方法。樣品以甲醇-水(體積比70∶30)溶液勻質(zhì)提取，過黃曲霉毒素B1免疫層析親和柱凈化，經(jīng)CNW Athena C18色譜柱分離和光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)器衍生后，用帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀測(cè)定。采用峰面積外標(biāo)法定量黃曲霉毒素B1含量。黃曲霉毒素B1在0～10 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為0.25 μg/kg。在3個(gè)添加水平下加標(biāo)回收率為97.7%～106.9%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7% (n=6)。該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均符合黃曲霉毒素B1的檢測(cè)技術(shù)要求，適用于嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素B1的日常檢測(cè)。

嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉；黃曲霉毒素B1；光化學(xué)柱后衍生；高效液相色譜

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)次級(jí)代謝物［1-4］，是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)的有20多種。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2和M1等在食品中較常見，它們的毒性由大到小的排列順序?yàn)辄S曲霉毒素B1，M1，G1，B2，G2［5-7］。其中B1是目前所有已知致癌物中致癌力最強(qiáng)的一種［6-8］，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為一級(jí)致癌物［9-10］。大量研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1不僅具有極強(qiáng)的致癌、致畸、致突變毒性，而且其急性毒性也很強(qiáng)。

嬰幼兒時(shí)期是人生長(zhǎng)發(fā)育最重要的時(shí)期，也是最脆弱的時(shí)期，嬰幼兒食品的安全容不得半點(diǎn)馬虎。輔食的材料大多是米、面為主，蔬果次之，如常見的嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［11］明確規(guī)定了黃曲霉毒素B1在嬰幼兒食品中的限量為0.5μg/kg，該限量值明顯低于谷物、豆類等其原料食品，因此嬰幼兒食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)要滿足檢出限低的要求。嬰幼兒食品中黃曲霉毒素B1的法定檢測(cè)方法為薄層色譜法［12］，該法的原理：樣品中的黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、凈化、濃縮、薄層層析分離后，在波長(zhǎng)365 nm紫外光照射下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光來(lái)測(cè)定其含量。薄層色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素B1具有靈敏度低、重現(xiàn)性差、操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)且安全性差等缺點(diǎn)，已越來(lái)越不適合現(xiàn)代分析的要求［13］。高效液相色譜法檢測(cè)糧食谷物［14-16］中黃曲霉毒素B1的研究較多，但嬰幼兒食品中黃曲霉毒素B1的高效液相色譜法檢測(cè)研究較少。20多年前羅建波等［17］曾研究過高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品中的黃曲霉毒素B1，但由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)、設(shè)備水平所限，樣品處理繁瑣，不便推廣應(yīng)用。

筆者在前期研究的基礎(chǔ)上［18］，換用新型色譜柱、優(yōu)化流動(dòng)相配比，大大縮短了分析時(shí)間，針對(duì)低含量樣品采用低標(biāo)準(zhǔn)線性系列，成功地進(jìn)行了嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素B1的免疫親和層凈化高效液相色譜法測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：L-2000型，配熒光檢測(cè)器，日本日立高新技術(shù)公司；

高速均質(zhì)機(jī)：T18型，廣州市科學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；

高速離心機(jī)：TG16-WS型，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)器：KRC-25型，北京泰樂琪科技有限公司；

黃曲霉毒素B1免疫層析親和柱：北京泰樂琪科技有限公司；

甲醇：色譜純；

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，北京泰樂琪科技有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇-水(體積比為55∶45)；流速：0.800 mL/min；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為420 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取25.000 g樣品于100 mL的具塞玻璃容量瓶中，用甲醇水(體積比為70∶30)溶液定容，搖勻后倒入250 mL的三角瓶中，并用25 mL的甲醇水溶液(體積比為70∶30)清洗容量瓶一并倒入三角瓶中，在高速勻質(zhì)機(jī)上勻質(zhì)2～3 min，取30 mL左右勻質(zhì)后的樣液以4 000 r/min離心5 min。取上層清液10 mL加入30 mL水稀釋，搖勻后過玻璃纖維濾紙過濾，取10 mL的過濾液通過黃曲霉毒素B1免疫親和柱，直至2～3 mL的空氣通過柱體，用10 mL的水沖洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2～3 mL的空氣通過柱體。取下柱子用2 mL的甲醇進(jìn)行緩慢洗脫，收集全部洗脫液進(jìn)行測(cè)定。

將20 μL樣品溶液和黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液先后用液相色譜儀熒光檢測(cè)器按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間定性，以響應(yīng)峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)了激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)420，440，450 nm幾種情況下的黃曲霉毒素的色譜峰情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)同時(shí)測(cè)定黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2時(shí)，在Ex 360 nm， Em 420 nm條件下G1，G2的峰響應(yīng)值偏低，B1，B2的峰響應(yīng)值偏高，隨著Em增大，B2，G2的峰響應(yīng)有增大趨勢(shì)，兼顧4個(gè)峰，Ex 360 nm， Em 450 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)；但在單獨(dú)測(cè)定黃曲霉毒素B1時(shí)，Ex 360 nm， Em 420 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。故采用激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)420 nm。

2.2 衍生方法

由于黃曲霉毒素B1具有較強(qiáng)的熒光性，但接觸水后易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，熒光性基本消失，很難用液相色譜檢測(cè)，所以需要用衍生的方法使黃曲霉毒素B1的熒光性增強(qiáng)。目前衍生的方法主要有三氟乙酸衍生法和碘衍生法。三氟乙酸衍生法操作步驟繁瑣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，而且三氟乙酸毒性很強(qiáng)，對(duì)人體和環(huán)境的危害較大；碘衍生法需要柱后衍生泵，還要配制碘衍生液，操作也很繁瑣［19］。而光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)器主要由反應(yīng)線圈和納米燈管組成，利用光化學(xué)的方法對(duì)黃曲霉毒素B1進(jìn)行衍生，該裝置不需要任何化學(xué)試劑，直接連接于色譜柱與熒光檢測(cè)器之間，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。因此實(shí)驗(yàn)選擇光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)器，大大提高了工作效率。

2.3 流動(dòng)相

采用甲醇-水作為流動(dòng)相，試驗(yàn)了CNW Athena C18色譜柱在3種不同流動(dòng)相配比(甲醇-水體積比分別為55∶45，50∶50，45∶55)下對(duì)目標(biāo)物的分離情況。在甲醇-水體積比為55∶45流動(dòng)相情況下，分離的色譜峰峰型單一、尖銳、對(duì)稱，目標(biāo)峰的分離度好，出峰時(shí)間最短，大大縮短了分析時(shí)間。故采用積比為55∶45的甲醇-水體作為流動(dòng)相。黃曲霉毒素B1標(biāo)樣色譜圖見圖1。樣品與加標(biāo)樣品色譜圖見圖2。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)樣(0.1～10.0 μg/L)色譜圖

圖2 嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉樣品(a)及其加標(biāo)樣品(b)色譜圖

2.4 線性方程及檢出限

用黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，對(duì)每個(gè)濃度水平分別測(cè)定(色譜圖見圖1)，以響應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1在0～10.0 μg/L范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=93 830x-4 548，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

隨試樣同時(shí)做空白試驗(yàn)，平行測(cè)定空白樣10次，求出空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以線性方程的斜率，得方法的檢出限為0.25 μg/kg，檢出限滿足我國(guó)嬰幼兒食品中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)0.5 μg/kg［11］。

2.5 回收試驗(yàn)

采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取相同的空白營(yíng)養(yǎng)米粉試樣3份，分別加入0.25，1.0，6.0 μg/L 3個(gè)不同濃度水平的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品本底同時(shí)進(jìn)行提取處理和測(cè)定，回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，在添加質(zhì)量濃度為0.25～6.0 μg/L時(shí)，黃曲霉毒素B1的回收率為97.7%～106.9%，回收率的測(cè)定結(jié)果符合國(guó)標(biāo)要求［20］。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.6 精密度試驗(yàn)

對(duì)加入1.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表2。由表2可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%，表明該法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

采用甲醇水溶液提取、免疫親和層析柱凈化，光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法，建立了嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法。對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行合理優(yōu)化，降低了檢出限，提高了回收率。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確度高，靈敏度好，實(shí)用性強(qiáng)，適用于嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素B1的日常檢測(cè)，便于在檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

［1］Deiner U L，Cole R J，Sanders T H，et al. Epidemiology of aflatoxin formation by Aspergillus flavus［J］.Annu RevPhytopathol，1987，25: 249-270.

［2］Kurtzman C P，Horn B W，Hesseltine C W.Aspergillus nomius，a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari［J］. Antoine van Leeuwenhoek，1987，53: 147-158.

［3］Cotty P J，Bhatnagar D.Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic pathway enzymes［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60: 2 248-2 251.

［4］Chang H L，Devries J W.Rapid high pressure liquid chromagraphic determination of aflatoxin M1 in milk and nonfat drymilk ［J］.Journal of Association Official Analysis Chemistry，1982，66(4): 913-917.

［5］馬志科，昝林森.黃曲霉毒素危害、檢測(cè)方法及生物降解研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(9): 91-94.

［6］范蓓，李慶鵬，哈益明.關(guān)注黃曲霉毒素國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)，完善食品安全保障措施［J］.食品工業(yè)科技，2010(12): 26-27.

［7］潘崴，龐廣昌，張昀.黃曲霉毒素與食品安全［J］.食品研究與開發(fā)，2004，25(6): 11-13.

［8］李書國(guó)，陳輝，李雪梅，等.糧油食品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法綜述［J］.糧油食品科技，2009，17(2): 62-65.

［9］Iarc W. Some naturally occurring substances: food items and constituents，heterocyclic aromatic amines，and myeotoxirts［J］. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to humans，1993，56: 245-362.

［10］Elisabete Y S，mario A，F(xiàn)abia Y，et al. Evaluation of fumonisinaflatoxin co-occurrence in Brazilian corn hybrids by ELISA ［J］. Food Addit Contam，2001，18(8): 719-729.

［11］GB 2761-2011 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量［S］.

［12］GB 5009.24-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M1和B1的測(cè)定［S］.

［13］張宸，岳田利，高振鵬，等.食品中黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008(7): 18-21.

［14］謝剛，王松雪，張艷.超高效液相色譜法快速檢測(cè)糧食中黃曲霉毒素的含量［J］.分析化學(xué)，2013，41(2): 223-228.

［15］劉堅(jiān)，余敦年，熊寧，等.高效液相色譜法對(duì)稻谷及稻谷籽粒中黃曲霉毒素的測(cè)定研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26(4): 107-110.

［16］姜兆興，曹旭，李智瑾.高效液相色譜法測(cè)定糧谷中黃曲霉毒素B1的研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2005，12(6): 61-63.

［17］羅建波，譚小秋.高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品中的黃曲霉毒素B1［J］.廣東衛(wèi)生防疫，1992，18(2): 52-55.

［18］丁軼聰，王桂苓，張偉偉.熒光色譜-柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定食品中的黃曲霉毒素B1［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2013，22(6): 56-58.

［19］Gobel R，Lusky K. Simultaneous determination of aflatoxins，ochratox in A，and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquid chromatography［J］. Journal of AOAC International，2004(2): 411-415.

［20］GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)［S］.

歡迎訂閱2014年《計(jì)測(cè)技術(shù)》

《計(jì)測(cè)技術(shù)》創(chuàng)刊于1958年，是中航工業(yè)北京長(zhǎng)城計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究所（國(guó)防科技工業(yè)第一計(jì)量測(cè)試研究中心）主辦的計(jì)量測(cè)試技術(shù)類期刊，雙月刊，逢雙月28日出版，國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行。

《計(jì)測(cè)技術(shù)》是中國(guó)核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄期刊，中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)源期刊，中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)、臺(tái)灣CEPS期刊數(shù)據(jù)庫(kù)全文收錄期刊。國(guó)際刊號(hào)：ISSN 1674-5795，國(guó)內(nèi)刊號(hào)：CN 11-5347/TB。

本刊為國(guó)防科技工業(yè)系統(tǒng)、部隊(duì)、民用計(jì)量測(cè)試院所、高等院校、相關(guān)設(shè)備制造商和各大公司服務(wù)。廣泛刊載長(zhǎng)、熱、力、電、無(wú)線電、時(shí)間頻率、光學(xué)、電離輻射、聲學(xué)等計(jì)量測(cè)試、校準(zhǔn)稿件。設(shè)有綜合評(píng)述，理論與實(shí)踐，新技術(shù)新儀器，計(jì)量、測(cè)試與校準(zhǔn)，計(jì)量信息化與管理，經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)等主要欄目。

歡迎訂閱2014年度雜志，本刊郵發(fā)代號(hào)：80-441；全年定價(jià)：60元。讀者可到各地郵局訂閱，也可直接與編輯部聯(lián)系。

通訊地址：北京市海淀區(qū)1066信箱雜志社 郵政編碼：100095

電話：010-62457159 (編輯部)，010-62457160(廣告部)，傳真：010-62457159，E-mail: mmt304@126.com

《計(jì)測(cè)技術(shù)》2014年第34卷第2期目次

綜述

動(dòng)態(tài)力校準(zhǔn)中需要規(guī)范的若干問題

理論與實(shí)踐

一種擺式加速度計(jì)結(jié)構(gòu)模態(tài)分析

一種EFPI光纖壓力傳感器的結(jié)構(gòu)分析及零點(diǎn)穩(wěn)定性

新技術(shù)新儀器

基于FPGA的超聲三維坐標(biāo)測(cè)量系統(tǒng)

液體流量標(biāo)準(zhǔn)裝置變溫系統(tǒng)設(shè)計(jì)

電能表溫度影響試驗(yàn)自動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)

一種新研閉環(huán)大電流傳感器校準(zhǔn)裝置

基于集散控制技術(shù)的某型電源控制器的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

輪胎氣壓表性能檢測(cè)裝置的研制

計(jì)量、測(cè)試與校準(zhǔn)

飛秒激光頻率梳測(cè)量光頻用拍頻裝置的實(shí)驗(yàn)研究

基于平臺(tái)測(cè)量的葉片榫頭測(cè)具檢測(cè)方法

基于QUINDOS6的整體葉輪葉型檢測(cè)

誤差與不確定度

稀釋倍數(shù)對(duì)氦氣中氬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度的影響

計(jì)量信息化及管理

數(shù)字化網(wǎng)絡(luò)在計(jì)量管理中的應(yīng)用

經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)

一種擴(kuò)展白熾光通量標(biāo)準(zhǔn)燈使用范圍的實(shí)用方法

提高密度計(jì)校準(zhǔn)結(jié)果準(zhǔn)確度的方法

恒溫槽校準(zhǔn)的四類因素的影響

淺議精密量具常用防銹油的熬制方法

Determination of Aflatoxin B1 in Rice Cereal for Infants and Young Children by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Post-Column Photochemical Derivatization

Wang Guiling， Xing Huabing， Li Linlin， Liu Beibei
(Fuyang Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Fuyang 236112， China)

A high performance liquid chromatography(HPLC) coupled with post-column photochemical derivatization method was developed for the determination of aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children. The sample was extracted with methanol-water (volume ratio was 70∶30) then purified by immunoaffinity column for the purification aflatoxin B1. The high performance liquid chromatography (HPLC) separation was performed on a CNW Athena C18column with methanol and water. The aflatoxin B1 was determined by fluorescence detection (FLD) after photochemical derivatization，and quantified by the peak area external standard method. The calibration curve showed good linearity in 0-10 μg/L range with correlation coefficient of 0.999 8. The limit of detection (LOD) was 0.25 μg/kg for aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children. The recovery of aflatoxin B1 spiked at there levels in rice cereal for infants and young children ranged from 97.7% to 106.9% with the relative standard deviation(RSD) of 1.7% (n=6). The sensitivity，accuracy and precision of the method can meet the technical standards requirement of the aflatoxin B1 determination. Therefore the method can be applied to the determination of the aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children.

rice cereal for infants and young children; aflatoxins B1; post-column photochemical derivatization; high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0028-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.008

聯(lián)系人：王桂苓；E-mail: wangguiling0536@126.com

2014-01-11