管玉成 李靜

金刷把為松蘿科植物金絲刷Lethariella cladonioides（Nyl.）Krog的枝狀體，苦，平；鎮(zhèn)靜，消炎，止痛。主治癲癇、精神分裂、神經(jīng)衰弱、頭目眩暈等癥；主產(chǎn)于陜西、四川、安徽、西藏、云南、河南等省，著生于海拔3000米以上枯木上。是陜西民間常用中草藥[1]，臨床應(yīng)用廣泛，歷史悠久。

金刷把作為地衣類藥材，含有地衣酸、地衣多糖及多種微量元素等。其中地衣多糖和異地衣多糖作為地衣菌絲細(xì)胞壁的主要成分是所有地衣都含有的化學(xué)成分[2]。從20世紀(jì)70年代以來對地衣多糖的抗腫瘤活性研究實驗證明，絕大多數(shù)地衣種類中所含的地衣多糖均具有極高的抗癌活性，特別值得重視的是地衣多糖的抗癌機理，不是直接殺傷細(xì)胞來抑制癌細(xì)胞的病態(tài)增殖，而是通過增強宿主的免疫防御系統(tǒng)來發(fā)揮作用的[3-9]。它可以激活機體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞不損傷健康細(xì)胞，只溶解、破裂或吞噬癌細(xì)胞。因而克服了在化療中健康細(xì)胞受損的嚴(yán)重副作用，既所謂的“中間宿主免疫性”[10-11]。金刷把具有藥物及食品保健的開發(fā)潛力，但以往由于缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其臨床應(yīng)用受到很大限制，因此本實驗建立了一種分光光度法測定金刷把多糖含量的測定方法，為制定金刷把藥材標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 AR1140型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），科偉恒溫水浴鍋（余姚長豐儀表廠）；雙光束紫外分光光度計UV-2550型（日本島津）；離心機Z200A型（德國Laboriechnik公司）；SHZ-3型循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪儀器廠）；SB 3200 DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；乙醇、濃硫酸、蒽酮等均為分析純；無水葡萄糖對照品（38075-200709）；藥材采自陜西省寶雞市太白山，由西安市藥檢所鑒定。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液 精確稱取于105 ℃干燥至恒重的無水葡萄對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并稀釋至刻度，再精密吸取10 mL置100 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

1.2.2 硫酸-蒽酮溶液的制備 精密稱取蒽酮0.10 g，放入100 mL棕色容量瓶中，逐漸加入濃硫酸溶液至刻度，搖勻使溶解完全，冷卻至室溫備用，注意避光保存。

1.2.3 供試品溶液的制備 稱取破碎后的金刷把1 g，放置于500 mL圓底燒瓶中，加50倍量水，置沸水浴中回流提取3次，每次提取1.5 h，趁熱用布氏漏斗抽濾，合并濾液。濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 mL，加95%乙醇60 mL，搖勻，放置于4 ℃下靜置24 h，離心，傾去上層液體，沉淀加水充分溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。精密量取2.5 mL置25 mL容量瓶中，定容搖勻作為待測溶液。

2 方法及結(jié)果

2.1 測定波長的選擇 分別精確吸取2 mL葡萄糖對照品溶液和試品溶液分別置2只具塞試管中，并加入蒽酮-硫酸試劑6 mL，充分振搖后靜置10 min，再放入冰水浴中冷卻10 min，取出。另以未加葡萄糖的溶液為空白液，于400~700 nm波長范圍掃描。測得對照品和樣品的最大吸收波長均為630 nm，故選擇630 nm波長測定。

2.2 硫酸用量的選擇 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，分別置于具塞試管中，并加入蒽酮-硫酸試劑4.0、6.0、8.0 mL，充分振搖后靜置10 min，再放入冰水浴中冷卻10 min，取出。在分光光度儀上630 nm處測定吸光度值。結(jié)果表明：濃硫酸用量為6.0 mL時，反應(yīng)即可完全，見表1。

表1 濃硫酸用量實驗結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mL于具塞試管中，各準(zhǔn)確加入蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，再加硫酸蒽酮試劑8 mL，搖勻后靜置10 min，冰水浴中冷卻10 min，取出。于630 nm處測定吸光度值。以吸光度（Y）對葡萄糖濃度（x）得出回歸方程Y=0.9707x+0.0089，R2=0.9993。在范圍20~100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液各1 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，依法測定吸光度，自冰水浴中取出后，每隔0.5小時測定一次，連續(xù)3 h測定吸光度考察其穩(wěn)定性，計算得RSD=1.98%，表明樣品溶液至少在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度實驗 取對照品溶液1 mL，按供試品測定項下操作測吸光度，平行測定6份。計算得RSD=1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 精密稱取樣品粉末6份，每份約1 g，按供試品測定項下操作測吸光度，考察操作方法的重現(xiàn)性，計算得RSD=0.75%（n=6）。

2.7 加樣回收率實驗 精密稱取3份樣品溶液0.4 mL置于具塞試管中，依次加入0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0.36、0.30、0.24 mL，并加入蒸餾水使總體積為1 mL，每個梯度各3份，空白對照為蒸餾水1.0 mL。按供試品溶液制備項下方法制備溶液，依法測定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出含量，計算得平均加樣回收率97.6%，RSD=1.44%。

2.8 樣品含量測定 精密稱取5份金刷把樣品，每份1 g，按照“1.2.3”項下所述方法制備供試品溶液，吸取待測液各2 mL置于具塞試管中，按照“2.3”項下所述方法測定吸光度，由回歸方程計算，結(jié)果見表2。最后計算樣品中多糖的平均含量為37.98 mg/L。

表2 樣品含量試驗測定數(shù)據(jù) mg/L

3 討論

多糖是由10個以上的單糖基通過苷鍵連接而成的極性大分子化合物，常用的提取方法有水浸提法、酸堿浸提法、酶法、鹽析法，微波提取法等，而植物多糖提取，以水浸提法最為普遍。多糖提取之后，還有許多雜質(zhì)要除去，一般利用多糖難溶于有機溶劑的特性，用乙醇或丙酮進(jìn)行反復(fù)沉淀洗滌。因為首次對金刷把多糖進(jìn)行研究，故選用最普遍簡單的水提醇沉法制備金刷把多糖。下一步研究可針對浸提溫度、時間、乙醇濃度、醇沉?xí)r間、醇沉次數(shù)等條件進(jìn)行多糖制備工藝優(yōu)化。

多糖檢測方法也有很多，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法、地衣酚法、Feling滴定法、間接碘量滴定法等，本實驗所用蒽酮-硫酸比色法是最常用的多糖測定方法之一，基本原理是多糖在濃硫酸的作用下，水解成單糖，然后脫水形成呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛衍生物，糠醛衍生物可以和許多芳胺、酚類以及具有活性次甲基的化合物縮合生成有色的化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與糖濃度成正比，從而可比色測定其含量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等，所以用蒽酮-硫酸法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在金刷把多糖初步研究中，用蒽酮-硫酸法可以一次測出多糖總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630 nm，故在此波長下進(jìn)行比色。本實驗反應(yīng)過程中顏色穩(wěn)定，在波長630 nm處和一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與樣品中多糖含量成正比，符合朗伯-比爾定律。實驗簡便準(zhǔn)確，而且通過精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率等試驗來驗證了這一方法的準(zhǔn)確可靠性。

在測定過程中，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與意酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。同時在實驗中發(fā)現(xiàn)蒽酮硫酸試劑一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，一次配夠量，配制時硫酸試劑要用同一批號，加入顯色試劑后需充分搖勻，冰水冷卻時間嚴(yán)格把握，否則操作過程中的這些差異均會影響測定結(jié)果。

多糖作為地衣類藥材的主要成分之一，已被發(fā)現(xiàn)地衣多糖具有多種生物活性，如免疫促進(jìn)、抗腫瘤等[11-13]。而目前對地衣多糖的研究還在不斷深入，所以建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的多糖含量測定方法對于金刷把的質(zhì)量評價和開發(fā)利用具有重要的意義。對金刷把多糖含量進(jìn)行了初步研究后發(fā)現(xiàn)金刷把中總多糖含量為37.98%，金刷把中地衣多糖含量如此之高，可能跟其生長環(huán)境有關(guān)，地衣生長速度極其緩慢，在體內(nèi)會產(chǎn)生積累大量具有生物活性的代謝產(chǎn)物，可以看出金刷把是一種非常有潛力的藥物資源，在新型藥物研究中具有廣遠(yuǎn)前景和重要意義，有望被開發(fā)成為新型藥物。本實驗為金刷把進(jìn)一步的質(zhì)量研究和開發(fā)利用提供了方法和依據(jù)。

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