馬俊洋,劉玲歌,吳星星,孫春然,郭聰敏,崔茂金,祝勇

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

酸處理麥稈酶解條件的優(yōu)化

馬俊洋,劉玲歌,吳星星,孫春然,郭聰敏,崔茂金,祝勇

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

以稀硫酸預處理的麥稈為底物,通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了底物的酶解條件.結果表明：酶解條件的主次順序為底物質量濃度、酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度和pH；最佳酶解條件為底物質量濃度0.25 g/L、酶質量濃度2 g/L、酶解時間36 h、酶解溫度45℃和pH為5.0,此時總還原糖含量最大為707.07 mg/g,糖含量顯著增加.酶解對于提高麥稈的糖化率是非常有必要的.

麥稈；纖維素酶；酶解；總還原糖；單因素試驗；正交試驗

我國農(nóng)作物秸稈資源非常豐富,每年產(chǎn)量為8.42×108t,而且以每年1.3%的速度增加[1].然而,我國的秸稈中,用作生活燃料的約占20%,用作飼料的約占15%,用作肥料還田的約占15%,用作工業(yè)原料的約占2%,直接燃燒或者被廢棄的約占33%,造成了嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[2].合理地利用秸稈資源不僅能夠緩解能源危機和保護環(huán)境,而且能夠實現(xiàn)農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展,是我國發(fā)展的一項重要任務.由于秸稈的組成比較復雜,性質比較穩(wěn)定,使得其生物降解難以進行,因此在被生物降解前需要對其進行預處理.秸稈的預處理方法有物理法、化學法、物理化學法和生物法[3-4].常見的預處理方法有酸預處理[5-6]、堿預處理[7-8]和酶預處理[9-10].

本文對稀硫酸預處理后底物的酶解條件進行優(yōu)化.首先利用單因素試驗分別研究了底物質量濃度、酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度和pH對總還原糖含量的影響,在此基礎上利用5因素4水平正交試驗對酶解條件進一步優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

1.1.1 原料麥稈來自河南省新鄉(xiāng)市郊區(qū),經(jīng)自然晾干、粉碎后于100℃下干燥3 h,備用.

1.1.2 儀器SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市華峰儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限責任公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；7200型紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；FZ102微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市予華儀器有限責任公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；臺式低速自動平衡離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）.

1.1.3 試劑纖維素酶（西安沃爾森生物技術有限公司）；硫酸（98%,分析純,鄭州派尼化學試劑廠）；葡萄糖（分析純,天津市德恩化學試劑有限公司）；苯酚（分析純,天津市德恩化學試劑有限公司）；檸檬酸（分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉（分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 酸預處理稱取5.35 g麥稈于圓底燒瓶中,加入1 L體積分數(shù)為7.89%的稀硫酸溶液,搖勻,油浴125℃下處理50.31 min后取出,洗滌至中性,烘干備用.

1.2.2 酶解稱取一定量的底物于50 mL圓底燒瓶中,分別加入20 mL不同pH的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液,將其放置于恒溫水浴鍋中在不同溫度下酶解不同時間,取出后稀釋一定的倍數(shù),測吸光度.每組試驗重復3次.總還原糖的測定采用苯酚-濃硫酸法[11].

1.2.3 試驗設計首先利用單因素試驗分別研究底物質量濃度、酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度和pH對總還原糖含量的影響,在此基礎上用5因素4水平正交試驗對酶解條件進一步優(yōu)化.正交試驗設計如表1所示.

表1 正交試驗設計Tab.1 Design of orthogonal experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶質量濃度的影響在溫度45℃、底物質量濃度0.25 g/L、時間12 h和pH為4.8時,酶質量濃度對總還原糖含量的影響如圖1所示.

圖1 酶質量濃度對總還原糖含量的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the content of total reducing sugars

由圖1可知,隨著酶質量濃度的增加,總還原糖含量逐漸增大.當酶質量濃度在3 g/L之前時有明顯的增大趨勢,之后隨著酶質量濃度的增加總還原糖含量基本不變,這是由于暴露在外面能被纖維素酶降解的纖維素被降解完了.當酶質量濃度在3 g/L時,總還原糖含量為563.66 mg/g,酶解后總還原糖含量顯著增加,說明酶解可以顯著提高底物的糖化率.

2.1.2 酶解溫度的影響在酶質量濃度3 g/L、底物質量濃度0.25 g/L、時間12 h和pH為4.8時,酶解溫度對總還原糖含量的影響如圖2所示.

圖2 酶解溫度對總還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the content of total reducing sugars

由圖2可知,隨著溫度的升高,總還原糖含量先增加后減小.當溫度為45℃時,總還原糖的含量最大,為567.33 mg/g.這是因為酶都有一個最佳溫度,當溫度低于最佳溫度時,酶的活性沒有達到最大；當溫度高于最佳溫度時,酶會有部分失活.

2.1.3 底物質量濃度的影響在酶質量濃度3 g/L、溫度45℃、時間12 h和pH為4.8時,底物質量濃度對總還原糖含量的影響如圖3所示.

圖3 底物質量濃度對總還原糖含量的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the content of total reducing sugars

由圖3可知,隨著底物質量濃度的增大,總還原糖含量逐漸下降.底物質量濃度在0.25 g/L時,總還原糖含量為562.32 mg/g.綜合考慮酶解成本和預處理效果,選擇底物質量濃度為0.25 g/L研究酶解時間和pH對總還原糖含量的影響.

2.1.4 酶解時間的影響在酶質量濃度3 g/L、溫度45℃、底物質量濃度0.25 g/L和pH為4.8時,酶解時間對總還原糖含量的影響如圖4所示.

圖4 酶解時間對總還原糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic time on the content of total reducing sugar

由圖4可知,隨著酶解時間的增加,總還原糖含量先增大后緩慢減小.這是由于酶解時間較長時,糖可能會部分被降解.當酶解時間為12 h時,總還原糖含量最大為566.22 mg/g.

2.1.5 pH的影響酶質量濃度為3 g/L、溫度45℃、底物質量濃度0.25 g/L和時間12 h時,pH對總還原糖含量的影響如圖5所示.

圖5 pH對總還原糖含量的影響Fig.5 Effect of pH on the content of total reducing sugar

由圖5可知,隨著pH的增大,總還原糖含量先增大后減小.當pH為4.8時,總還原糖含量最大為563.39 mg/g.這是因為酶都有一個最佳的pH,在最佳pH時,酶的活性最大.

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上設計了5因素4水平L16（45）的正交試驗,正交試驗設計及結果如表2所示.

表2 正交試驗設計及結果Tab.2 Design and results of orthogonal experiments

由表2可知,在底物質量濃度為0.25 g/L、酶質量濃度為2 g/L、時間為36 h、溫度為45℃和pH為5.0時,總還原糖含量最大為707.07 mg/g.通過極差分析可以得出,5個因素對總還原糖含量影響的主次順序為底物質量濃度、酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度和pH.

3 結論

本文以稀硫酸預處理的麥稈為底物,通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了酶解條件,得出了如下結論：影響酶解條件因素的主次順序為底物質量濃度、酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度和pH；最佳酶解條件是底物質量濃度為0.25 g/L、酶質量濃度為2 g/L、溫度為45℃、時間為36 h和pH為5.0,此時總還原糖含量為707.07 mg/g.酶解后糖含量顯著增加,說明酸預處理的麥稈酶解可以提高麥稈的糖化率.

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（責任編輯：鄧天福）

Optimization of enzymolysis conditions for wheat straw treated by acid

Ma Junyang,Liu Lingge,Wu Xingxing,Sun Chunran,Guo Congmin,Cui Maojin,Zhu Yong
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Enzymolysis conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiments using wheat straw which was pretreated by dilute sulphuric acid（H2SO4）.The results showed that the primary and secondary factors of enzymolysis conditions were substrate concentration,enzyme concentration,enzymatic time, enzymatic temperature and pH.The optimal enzymolysis conditions were substrate concentration of 0.25 g/L,enzyme condition of 2 g/L,enzymatic time of 36 h,enzymatic temperature of 45℃and pH of 5.0.The maximum of total reducing sugar concentration was 707.07 mg/g at the optimal enzymolysis conditions,sugar yield increased dramatically,indicating that enzymolysis is very necessary to improve the saccharification efficiency of wheat straw.

wheatstraw；cellulase；enzymolysis；totalreducingsugars；singlefactorexperiment；orthogonal experiments

X712

A

1008-7516（2014）04-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.004

2014-04-28

河南科技學院大學生創(chuàng)新訓練項目（2013CX062）

馬俊洋（1991-）,男,河南南陽人.

崔茂金（1980-）,男,山東臨沂人,博士,講師.主要從事農(nóng)林生物質資源化研究.