高潔，劉彎，曹丹，郜慧英

（1菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000；2定陶縣人民醫(yī)院重癥監(jiān)護科；3附屬菏澤市立醫(yī)院婦產(chǎn)科）

P53和CD44v6在食管鱗癌中的表達及其臨床病理意義

高潔1，劉彎2，曹丹3，郜慧英1

（1菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000；2定陶縣人民醫(yī)院重癥監(jiān)護科；3附屬菏澤市立醫(yī)院婦產(chǎn)科）

目的探討P53和CD44v6在食管鱗狀細胞癌中的表達及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性，并分析其與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法制作組織芯片并應(yīng)用免疫組織化學(xué)PV-9000二步法檢測52例食管鱗狀細胞癌組織和18例食管炎癥炎組織中P53及CD44v6的表達，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并探討P53和CD44v6之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果P53和CD44v6在食管鱗癌中的表達高于在食管炎組中的表達（P＜0.05），且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌病例中的陽性率遠高于其在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率（P＜0.05）；P53和CD44v6在食管鱗狀細胞癌中的表達無明顯相關(guān)性(r=0.202，P＞0.05)。結(jié)論P53和CD44v6在食管鱗狀細胞癌中表達明顯上調(diào)，其高表達預(yù)示轉(zhuǎn)移性大及預(yù)后較差。

P53；CD44v6；食管鱗癌；組織芯片

食管癌是全球常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤死亡原因的第五位[1]。在魯西南地區(qū)食管癌的發(fā)生率逐年增高，并以鱗狀細胞癌為主要病理類型。近年來隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展及普遍應(yīng)用，可以應(yīng)用于食管癌中用來評估患者的惡性程度。本研究以P53和細胞表面黏附分子CD44v6為重點，來探討其在食管鱗狀細胞癌中的表達意義。現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料收集2012年1—12月山東菏澤市立醫(yī)院病理科石蠟標(biāo)本70例。其中食管鱗狀細胞癌標(biāo)本52例，男35例，女17例，平均年齡65.2歲;食管炎癥標(biāo)本18例，男11例，女7例，平均年齡54.1歲。食管癌病例來自外科手術(shù)切除標(biāo)本，食管炎癥病例來自胃鏡活組織檢查標(biāo)本，所有病例均經(jīng)過病理組織學(xué)檢查確診。

1.2 主要試劑[2]及器材即用型鼠抗人P53單克隆抗體、即用型鼠抗人CD44v6單克隆抗體，PV-9000通用免疫組化二步法檢測試劑盒，EDTA抗原修復(fù)液（pH值9.0），DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均由院病理科提供。

1.3 構(gòu)建組織芯片[3]使用組織芯片儀制備6行×5列的受體蠟塊，在石蠟標(biāo)本上標(biāo)記并采集組織填塞入受體蠟塊孔內(nèi)，每個病例取雙標(biāo)本以防組織丟失，第一行頭四孔填塞白蠟造成組織空缺作為標(biāo)本定位依據(jù)。每個受體蠟塊容納26個組織，共計13例標(biāo)本。食管癌組織構(gòu)建2個組織芯片，56度烤箱內(nèi)反復(fù)熔蠟成為一體，和食管炎活檢組織一起4μm連續(xù)切片備用。

1.4 免疫組織化學(xué)染色[4]將切片脫蠟水化，乙二胺四乙酸（EDTA）微波抗原修復(fù)，3℅H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗P53或CD44v6，37℃孵育2小時。二抗滴加嚴(yán)格按照說明書步驟進行；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 結(jié)果判斷P53為胞核染為淡黃至棕黃色，CD44v6的陽性著色為胞膜出現(xiàn)黃色至棕黃,。根據(jù)顯色的程度來判斷陽性程度：標(biāo)本無黃色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分；根據(jù)陽性細胞在觀察細胞中所占的比例分為：陽性細胞數(shù)＜10%為1分，10%～50%為2分；51%～75%為3分，＞75%為4分。兩類分數(shù)乘積的結(jié)果：0～3分為（-），4～6分為（+），6～8分為（++），8分以上為（+++）。+～+++均判定為陽性[5]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對所有計數(shù)資料行χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 P53和CD44v6的表達P53表達于細胞核內(nèi)，呈淡黃色至棕黃色分布（見圖2），其在52例食管鱗狀細胞癌組織中的陽性率為67.3%，18例食管炎對照組織中陽性率為22.2%，P53在食管鱗癌中的表達高于食管炎對照組中的表達（P＜0.05）。CD44v6表達于細胞膜，呈淡黃色至棕黃色分布（見圖3），52例食管鱗癌組織中CD44v6的陽性率為77.0%，遠高于18例食管炎對照組中的陽性率（16.7%），CD44v6在食管鱗狀細胞癌組織中的表達遠高于食管炎癥組織（P＜0.05）。

2.2 P53與CD44v6的表達及與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系1）按性別分組：食管鱗癌組52例，其中男35例，P53陽性26例，陰性9例，CD44v6陽性29例，陰性6例；女17例，P53陽性9例，陰性8例，CD44v6陽性11例，陰性6例。2）按年齡分組：食管鱗癌組52例，其中小于60歲20例，P53陽性14例，陰性6例，CD44v6陽性15例，陰性5例；大于等于60歲32例，P53陽性21例，陰性11例，CD44v6陽性25例，陰性7例。3）按腫瘤類型分組：食管鱗癌組52例，其中高中分化腺癌29例，P53陽性19例，陰性10例，CD44v6陽性21例，陰性8例；低分化腺癌23例，P53陽性16例，陰性7例，CD44v6陽性19例，陰性4例。4）按侵襲程度分組：食管鱗癌組52例，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，P53陽性28例，陰性6例，CD44v6陽性30例，陰性4例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，P53陽性7例，陰性11例，CD44v6陽性10例，陰性8例。P53和CD44v6的表達與年齡、性別、腫瘤類型等因素?zé)o明顯相關(guān)，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），即P53和CD44v6在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯增高。

2.3 P53和CD44v6表達的關(guān)系35例P53表達陽性的病例中CD44v6陽性數(shù)為29例，陰性數(shù)為6例，17例P53表達陰性的病例中CD44v6的陽性數(shù)為11例，陰性數(shù)為6例，采用Spearman相關(guān)性檢驗得出r= 0.202，P=0.151，證實P53與CD44v6在食管癌中的表達無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

腫瘤是一個多步驟和多基因共同作用造成的結(jié)果[6]，其中癌基因的激活與抑癌基因的失活是一個重要的因素。P53基因有3種類型，分別為野生型、突變型和介于兩者之間的雜合子狀態(tài)[7]。野生型P53參與基因的合成及損傷修復(fù)、調(diào)控細胞周期，在細胞增生分化、細胞凋亡的誘導(dǎo)及維護細胞基因組完整性的過程中發(fā)揮著重要作用。而突變型P53基因就失去了抑制腫瘤的功能，P53蛋白的作用完全失活[8]，生物體內(nèi)的腫瘤中常常出現(xiàn)野生型P53基因丟失和（或）突變，野生型P53在體外可抑制病變癌基因和細胞癌基因的轉(zhuǎn)化過程，提示其具有抑癌的功能[9]。P53是細胞凋亡過程中的重要調(diào)控因子，發(fā)生突變與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。

在本研究中，P53蛋白在食管鱗狀細胞癌中的陽性率顯著高于其在食管炎中的陽性率，證明在食管鱗癌組織中P53表達增高（P＜0.05），并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示P53陽性的鱗癌病例更易發(fā)生腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。在性別、年齡及腫瘤類型的表達中P53無顯著性差異，這與朱東兵等[10]的研究稍有不符。

CD44近年來在腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域研究較多，與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，其亞型CD44v6是第一個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD44黏附分子，是一種分布廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，它能介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的特異性黏附過程，在多種腫瘤中表達，上調(diào)，能夠改變腫瘤細胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，顯著增強腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[11]，目前，對于CD44v6在食管鱗癌癌中的研究在國內(nèi)并不多見。在本組實驗當(dāng)中，相對于食管炎對照組，CD44v6在食管鱗癌中的表達增高（P＜0.05），并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），與性別、年齡和腫瘤類型等臨床病理指標(biāo)無顯著性差別。

對于P53和CD44v6在食管鱗狀細胞癌中的表達情況作相關(guān)性分析，二者并不同步（r=0.202，P＞0.05），因此對于P53表達陽性的食管鱗癌病例具有更高轉(zhuǎn)移潛能的推論還需進一步證實。

正常組織中P53蛋白的表達很少，而原位癌時P53蛋白的陽性檢出率高達20%，故P53蛋白陽性的食管炎患者應(yīng)定期復(fù)查，密切隨訪[12]。最新研究認為，食管癌變過程中P53基因突變和蛋白產(chǎn)物的積聚先于腫瘤的浸潤，是癌變過程中的早期事件。苗成立[13]等研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白在癌遠旁組織，癌近旁組織及食管癌灶中陽性率逐步提高，提示P53參與食管癌變過程的可能性大，配合黏附分子CD44v6的聯(lián)合免疫組化檢測，一來可以應(yīng)用于早期食管癌或癌前病變的篩查，二來可以更精確的判斷食管鱗癌的惡性程度和預(yù)后，有利于為患者制定更合理的治療方案。

本研究采用了制作組織芯片的技術(shù)方法，保證了實驗條件的同步性，得到的結(jié)果較為可靠，下一步將繼續(xù)收集食管鱗癌病例，補充病例數(shù)量，進一步完善結(jié)果。

圖1：食管鱗狀細胞癌（HE，×20）

圖2：P53在食管鱗癌中的陽性表達（PV-9000，×20）

圖3：CD44v6在食管鱗癌中的陽性表達（PV-9000，×20）

[1]王志敏，杜云翔，山順林，等.2009-2011年淮安市食管癌流行病學(xué)與治療現(xiàn)狀分析[J].中華腫瘤防治雜志，2013,20（5）：334-337.

[2]楊宣琴，王全紅，焦士蘭，等.食管鱗癌中P53和CD44V6的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].實用醫(yī)技雜志，2004，11（23）：2496-2498.

[3]周小鴿，張勁松，張小平,等.組織芯片[J].中華病理學(xué)雜志,2002,31 (1)∶70-72.

[4]楊其昌，馮一中，沈屹，等.組織芯片技術(shù)在胃癌p53蛋白表達研究中的應(yīng)用[J].蘇州大學(xué)學(xué)報，2005，25（5）：816-821.

[5]許良中，王文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國癌癥雜志，1996,6（4）：229-231.

[6]張琳，吳興平，丁偉龍，等.Cyfra21-1和CEA及CRP聯(lián)合檢測對食管癌診斷價值的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2012,19（9）：667-670.

[7]Jaskiewicz K,De Groot KM.P53 gene mutants expression,cellular proliferation and differentiation in oesophageal carcinoma and noncancerous epithelium[J].Anticancer Res,1994,14(1A):137-140.

[8]姜孝芳.食管癌相關(guān)基因突變的研究進展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010,33（7）：752-754.

[9]馬艷會，路志濤，周永寧，等.大腸腺癌組織PTTG和VEGF-A及P53表達生物學(xué)意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2012,19（15）：1162-1165.

[10]朱東兵，陳正言，朱小平，等.食管癌變過程中P53表達及其與細胞凋亡水平的關(guān)系[J].腫瘤學(xué)雜志，2010,16（12）：950-953.

[11]沈志力，王芬.CD44v6在胃癌臨床治療中的意義[J].醫(yī)學(xué)信息，2011,24（9）：6075-6076.

[12]劉復(fù)生，劉彤華.腫瘤病理[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997:20.

[13]苗成利，楊金良.食管癌及癌旁組織P53蛋白、VEGF及MVD聯(lián)合檢測的臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009,11（6）：57-60.

Clinicopathological Significance of P53 and CD44v6 Expression in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

Gao Jie1,Liu Wan2,Cao Dan3,Gao Huiying1(1Heze Medical College,Heze 274000，Shandong;2The People's Hospital of Dingtao County；3Heze Municipal Hospital)

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of P53 and CD44v6 in esophageal squa?mous cell carcinoma and clinicopathological parameters,and to analyze its relationship with tumor invasion and metastasis.MethodsMaking tissue microarray and using immunohistochemical PV-9000 two step method to detect 52 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues and 18 cases of esophageal inflammation of tissues,analyze the relationship be?tween the clinical and pathological parameters using SPSS19.0 statistical software,and to explore the correlation between P53 and CD44v6.ResultsThe expression of P53 and CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma was higher than that in esophagitis in the group(P＜0.05),and in patients with lymph node positive rate of metastasis of squamous cell carci?noma cases is much higher than in the no lymph node metastasis group（P＜0.05);There is no significant correlation be?tween the expression of P53 and CD44v6 in the esophageal squamous cell carcinoma(r=0.202,P＞0.05).ConclusionP53 and CD44v6 expression are significantly increased in esophageal squamous cell carcinoma,which suggests that high expression of metastasis and poor prognosis.

P53；CD44v6；esophageal squamous cell carcinoma；tissue chip

R735.1；R392.3

A

1008-4118（2014）03-0004-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.03.02

2014-05-29

高潔（1986-），女，主要從事護理教學(xué)與免疫病理研究。