成克倫

（貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000）

抗原修復間接法不同修復時間的效果比較

成克倫

（貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000）

目的探討抗原修復間接法在不同修復時間內的修復效果。方法采用不同修復時間的間接法對同一組織進行抗原修復，檢測15種常用抗體的染色效果并和直接法比較。結果抗原修復間接法在不同修復時間修復效果存在差異。結論選擇合適的修復時間對抗原進行間接法修復能達到理想效果，可在臨床和科研中應用。

抗原修復；間接法

甲醛固定的標本，因抗原決定簇和醛的交聯作用而使抗原被封閉，在進行抗體標記前，要通過修復的方法盡量把抗原暴露出來?？乖迯偷闹苯臃ㄊ侵笇⑿迯鸵褐苯臃湃敫邏哄亙葘η衅M行加熱修復，而間接法是指把修復液先放入容器內再放入高壓鍋中，然后對容器里的切片進行加熱修復。本文通過不同修復時間的間接法和直接法對比實驗，探討合適修復時間的間接法在免疫組化中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本選取我院病理科2013年6月—12月已證實抗原表達呈陽性的腫瘤標本15例，標本經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，厚4 μm。

1.1.2 試劑常用抗體P63、CD56、SY、ER、PR、C-erbB-2、CK-pan、CD34、Bcl-2、CD45、TTF-1、CK5/6、P504S、CD117、CD2共15種。檸檬酸抗原修復液（0.01 M，PH 6.0）、EDTA抗原修復液（0.01 M，PH 9.0）、PBS緩沖液（0.01 M，PH 7.4）、即用型快捷免疫組化MaxvisionTM試劑盒。以上試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.1.3 儀器烤箱、電熱高壓鍋、培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 直接法高壓鍋法：取一定量檸檬酸抗原修復液(1500 ml)放入高壓鍋中，加熱至沸騰，將置于耐高溫塑料架上的切片放入，蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加熱2 min，打開排氣閥，冷卻至室溫備用。煮沸法：取EDTA抗原修復液(1500 mL)放入高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入，蓋上鍋蓋（不擰緊不扣壓力閥），繼續(xù)加熱20 min，冷卻至室溫備用。

1.2.2 間接法高壓鍋法：取一定量(250 mL)檸檬酸抗原修復液于耐高溫塑料容器中，將容器放入盛水的高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入容器內，蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加熱，分別在2、3、5 min后，打開排氣閥，測量容器內外溫度，取出容器，冷卻至室溫備用。煮沸法：取EDTA抗原修復液(250 ml)于耐高溫塑料容器中，將容器放入盛水的高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入，蓋上鍋蓋（不擰緊不扣壓力閥），繼續(xù)加熱，分別在5、10、20、25、30 min后，測量容器內外溫度，取出容器，冷卻至室溫備用。

1.2.3 免疫組化染色檢測步驟參照試劑盒操作說明進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，每種抗體均用即用型抗體濃度進行實驗。染色結果判斷按陽性細胞百分數和染色強度計分：百分數為0計0分，＜25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；染色強度無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩種計分相加，0分為陰性（-），2～3分為陽性（+），4～5分為陽性（++），6～7分為陽性（+++），由2位病理醫(yī)師采用雙盲法進行評分。

2 結果

在高壓鍋間接法中，剛沸騰時容器內外溫差相差較大（14℃），隨著時間的增加，3min后，容器內外溫度接近（95～96℃）；在煮沸間接法中，剛沸騰時容器內外溫差相差14℃，時間增加至10min后，容器內外溫度接近（95～96℃）（見表1）。隨著時間增加，染色效果逐漸增強，在高壓鍋間接法中加熱5min后以及在煮沸間接法中加熱30min后，修復所經歷的單位時間溫度（95℃2min、95℃20min）與直接法相當，染色效果接近（見表2、3）。

表1 間接法加熱容器內外溫度比較（℃）

表2 高壓鍋間接法和直接法實驗結果對比

表3 煮沸法中間接法和直接法實驗結果對比

3 討論

目前，免疫組化已成為臨床病理診斷必不可少的輔助手段，在鑒別診斷、預后評估和指導治療等方面起著非常重要的作用。染色過程中抗原修復是關鍵步驟，它能把甲醛固定的標本封閉的抗原決定簇中的交聯結構打破，使抗原蛋白分子鏈脫離其它束縛或聯結，恢復抗原的原有空間形態(tài)，使抗原不同程度重新暴露出來，更好地與相應抗體反應，提高陽性表達率和表達強度，達到理想的標記效果，大多數標本都要經過這一處理，是決定染色成敗的主要因素之一[1]?？乖迯椭苯臃ǖ男迯托Ч强隙ǖ模珜τ谛∨康娜旧迯鸵豪速M過大。本實驗發(fā)現，用相同的時間對同一抗原進行修復，間接法和直接法修復效果相差較大，但用不同的時間通過間接法對抗原進行修復，隨著時間的增加，修復效果逐漸增強。當容器內外的溫度接近時，再用直接法相同的時間繼續(xù)加熱，最終能達到與直接法相當的修復效果，說明選擇合適的修復時間應用間接法對抗原進行修復是可行的，與齊文娟等[2]報道一致。

在抗原修復間接法中，用檸檬酸抗原修復液進行高溫高壓修復時，加熱到3 min，容器內外溫度接近，故筆者認為加熱時間選擇為5 min修復效果較好，因修復所經歷的單位時間溫度（95℃、2 min）及染色效果與直接法相當；用EDTA抗原修復液進行煮沸修復時，加熱到10 min時，容器內外溫度接近，故加熱時間為30 min修復效果較好，修復所經歷的單位時間溫度（95℃、20 min）及染色效果與直接法相當。本間接法雖然增加了總染色時間，但節(jié)省了修復液，還避免了鍋體釋放金屬離子對修復的影響[3]，對小批量的抗體標記染色比較實用，也適合在標本量少的基層醫(yī)院推廣。由于加熱時間增加，脫片機率有所增加，除切片薄切外，玻片清潔徹底能克服這一缺點，用廠家經過系列處理的專用免疫組化染色玻片效果更好。容器外水位應低于容器3 cm左右，以免沸水濺入容器而改變修復液濃度和pH值從而影響修復?？乖迯偷耐暾麢C制還沒有完全弄清楚，有待于進一步研究。修復目前還未標準化，也沒有一種抗原修復方法能適合各種抗體[4]，抗原修復受標本固定液、蠟塊保存時間長短、修復液種類、時間、溫度、壓力和pH值多種因素影響。在實際工作中應探索最佳的技術條件，不斷提高免疫組化技術水平，客觀地為病理診斷提供可靠依據。

[1]羅煥超，余琦，楊江輝，等.不同冷卻方法對免疫組化檢測結果的影響[J].標記免疫分析與臨床，2009，16（4）：259.

[2]齊文娟，申洪.提高陳舊性石蠟標本抗原檢出率的抗原修復方法[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26(10):1761-1763.

[3]李德本，王濤，姜駿，等.免疫組化染色的操作技巧和注意事項[J]。臨床與實驗病理學雜志，2011，27（11）：1260-1261.

[4]楊軍.生理鹽水作為抗原修復液的可行性[J].臨床與實驗病理學雜志，2009，25（2）：217-218.

Antigen Repair Indirect Effect Comparison of Different Time to Repair

Cheng Kelun
(Department of Pathology,Guizhou Aerospace Hospital,Zun yi 563000,Guizhou)

ObjectiveTo investigate the antigen repair the indirect method in different time to repair repair effect.MethodsUsing different repair time of the indirect method to repair the same tissue antigens,antibodies detection of 15 kinds of commonly used dyeing effect and compared with the direct method.ResultsAntigen repair the indirect method in the different time to repair repair effect is different..ConclusionTo choose the appropriate time to repair the indirect method for antigen repair can achieve ideal effect,can be applied in clinical and scientific research.

antigen repair;the indirect method;the effect;to compare

R392.3

A

1008-4118（2014）03-0007-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.03.03

2014-05-06