周升緒 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

疑似感染豬圓環(huán)病毒2型病例的確診

周升緒 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

山東省諸城市某豬場(chǎng)送檢了一起臨床疑似感染豬圓環(huán)病毒2型的仔豬，臨床表現(xiàn)為消瘦，腹部甚至全身皮膚表面有硬幣大小的斑塊；呼吸急促困難；個(gè)別仔豬存在腹瀉。通過(guò)臨床剖檢發(fā)現(xiàn)全身淋巴結(jié)腫大，切面白色多汁；肝硬變；肺臟腫脹間質(zhì)增寬；腎臟水腫，蒼白，被膜下有大小不一的白斑，髓質(zhì)部有點(diǎn)狀出血。分別采集病豬腹股溝淋巴結(jié)、部分肺臟和部分腎臟研磨后取上清，行了PCR鑒定。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型基因序列設(shè)計(jì)合成的一對(duì)引物，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，擴(kuò)增片段與目的片段大小相符，進(jìn)一步證實(shí)該豬場(chǎng)的病豬感染了豬圓環(huán)病毒2型病毒。德國(guó)人于1974年在PK-15細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了一種與細(xì)小病毒類似的顆粒，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是一種細(xì)胞污染物。1982年，有人通過(guò)對(duì)這種細(xì)胞污染物進(jìn)行提純鏡檢及核酸鑒定，最后確定為一種新的病毒，并命名為豬圓環(huán)病毒(PCV)。根據(jù)圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異，將PCV劃分無(wú)致病性的PCV1和有致病性的PCV2兩個(gè)基因型。PCV2與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征密切相關(guān)，PCV2主要侵害機(jī)體得免疫系統(tǒng)，能造成免疫抑制，常常與PRRSV 、PPV等造成混合感染，嚴(yán)重影響豬體的健康及生產(chǎn)性能。目前我國(guó)許多地區(qū)都有PCV2存在，該病給我國(guó)及世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界公認(rèn)為重要的豬傳染病。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 取病變典型的病豬肺臟腹股溝淋巴結(jié)、部分肺臟以及部分腎臟，于-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 DL-2000 DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司)、蛋白酶K、飽和酚、瓊脂糖等(購(gòu)自金博生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純品。

1.1.3 主要儀器 DYY-2型瓊脂糖凝膠電泳槽(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司)、2A200型電泳儀(Amersham公司)、生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、超純水(自寶生物工程有限公司)、DTC-200型PCR儀(MJ Reaserch 公司)、BCD-251型冰箱(Hisense公司)、移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根據(jù)NCBI上發(fā)表的PCV2全基因序列，參照Fenaux等設(shè)計(jì)1對(duì)引物: PF、PR用于擴(kuò)增PCV2全基因序列，引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。PF：TGTCCGCGG GCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA，PR：GCCCGCGG AAATTTCTGACAAACGTTACA。

1.2.2 對(duì)病料用蛋白酶K裂解法提取總DNA 取稱取病死豬的腹股溝淋巴結(jié)各0.5g于研缽中，用剪刀剪碎，加入2.0mlPBS緩沖液，研磨。取研磨液500μl于1.5ml離心管中，按終質(zhì)量濃度為20mg/L蛋白酶K、1%SDS 56℃消化2h，然后用等體積的酚：氯仿(1:1)抽提組織中的總DNA，最后用2倍體積的冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，并將DNA溶解在100μl滅菌超純水中，其后取2μl作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 利用設(shè)計(jì)的PCR引物，以上述DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃ 9min，94℃變性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。取5μl PCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢病變

通過(guò)觀察送檢疑似感染豬圓環(huán)病毒2型的病豬，臨床上主要表現(xiàn)為消瘦，腹部皮膚表面有硬幣大小的斑塊，呼吸急促困難。剖檢發(fā)現(xiàn)該病最明顯的病變是淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性黏液腫性支氣管炎，腸、胃、回盲瓣黏膜有出血，肺臟外觀灰色至褐色呈斑駁狀，質(zhì)地似橡皮，脾腫大、壞死色暗，腎蒼白、腫大、有壞死灶，心包炎，胸腔積水并有纖維素性滲出。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性對(duì)照及送檢樣品在703bp處均出現(xiàn)目的條帶(附圖)，與預(yù)期結(jié)果相符。確診該病豬感染豬圓環(huán)病毒2型。

附圖 1.陽(yáng)性對(duì)照；2.腹股溝淋巴結(jié)；3.肺臟；4.腎臟

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)送檢病豬臨床癥狀和剖檢病理癥狀的觀察以及PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷方法確診了一例感染豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病例，以該養(yǎng)殖戶為中心對(duì)周圍養(yǎng)殖小區(qū)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)周圍養(yǎng)殖小區(qū)普遍存在疑似感染PCV2現(xiàn)象，證實(shí)了該病毒在山東省諸城市流行的可能，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的預(yù)防。

結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，特建議：(1）加強(qiáng)養(yǎng)殖小區(qū)的衛(wèi)生管理，防治病原菌侵入豬群，實(shí)行全進(jìn)全出的飼養(yǎng)管理制度。（2）加強(qiáng)豬群的免疫，定期預(yù)防接種，增強(qiáng)豬群的特異免疫力。（3)選擇合適疫苗，對(duì)發(fā)病豬群要進(jìn)行緊急預(yù)防接種。

S858.28

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1007-1733(2014)09-0033-02

2014–08–07）