董蓮華， 李 亮， 周云龍， 曹應龍，沈 平， 盧長明， 王 晶， 劉張嵐

（1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.農業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國農科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

轉基因玉米T25基體標準物質協同實驗研究

董蓮華1， 李 亮1， 周云龍2， 曹應龍3，沈 平2， 盧長明3， 王 晶1， 劉張嵐1

（1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.農業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國農科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

對轉基因玉米T25轉化體特異性熒光定量PCR方法的關鍵參數進行了方法驗證，選擇了7家實驗室采用經過驗證的方法對3個水平的轉基因玉米T25基體標準物質進行協同實驗研究。通過比較分析各參與實驗室的實驗條件、標準曲線的參數，進一步證明該方法室間重復性好。經統(tǒng)計學分析各參與實驗室的數據等精度，因此計算各實驗室的總平均值做為標準物質的標準值。3個水平的基體標準物質的標準值和擴展不確定度（k＝2）分別為1.17%±0.22%、2.17%±0.38%和9.81%±2.30%。

計量學；轉基因玉米；T25；基體標準物質；實時熒光定量PCR

1 前 言

轉基因玉米在全球范圍的大面積種植，使其食用安全和環(huán)境安全問題引起了各國政府和相關國際組織的高度重視，各國紛紛出臺了轉基因生物安全管理相應的法規(guī)，這對轉基因植物檢測技術的靈敏度和準確性提出了挑戰(zhàn)。目前我國農業(yè)部已頒布了轉基因玉米定性PCR檢測方法的國家標準，然而尚缺乏轉基因玉米產品的標準物質，而無法保證轉基因檢測結果的準確、可靠和可比性，因此加快轉基因玉米標準物質的研制勢在必行。

轉基因玉米T25為拜耳公司生產的具有草丁膦抗性的轉基因玉米，該品種中Camv35s啟動子與nos終止子一同控制草丁膦抗性基因PAT。PAT是來源于桿菌Bacillus amyloliquefaciens草丁膦乙酰轉移酶基因，它能使草丁膦中游離氨基乙?；Щ睢AT與已知的120多種人體蛋白無同源性。目前，美國、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國家已批準該轉基因玉米在飼料中使用。為了加強對該轉基因玉米的檢測，美國油料化學學會（AOCS）已經研制了該玉米的葉片基因組DNA分子標準物質［1］。目前對于生物標準物質，尤其是轉基因標準物質，可參考的定值方法較少，實時熒光定量PCR方法是目前可以進行轉基因定量檢測比較成熟的方法［2～4］，本文選擇多家協同定值方式對研制的基體標準物質進行協同研制，并且使用的定值方法（轉基因玉米T25轉化體特異性和玉米內標基因特異性定量PCR方法）是經過歐盟確認的標準方法［5］，但在使用該方法定值前本文先對方法進行了驗證［6］，然后選擇6～8家實驗室采用實時熒光定量PCR方法對研制的轉基因玉米T25基體標準物質進行聯合定值。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 轉基因玉米T25陽性和陰性材料

轉基因玉米T25陽性和陰性材料由農業(yè)部科技發(fā)展中心提供；轉基因玉米T25 A、B、C 3個含量水平基體標準物質：由中國農業(yè)科學院油料作物研究所研制；轉基因玉米T25陽性基因組DNA，購自美國油料化學會（AOCS）標準值（轉基因質量比）大于999.9 ng／μg，不確定度可以忽略（詳見該標準物質證書）。

2.1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、購自天根生化科技有限公司，定量PCR試劑盒購自美國ABI北京分公司。

2.1.3 特異性引物和探針

本實驗所使用的引物探針均由上海英俊公司合成。其中探針5’端采用熒光標記基團FAM進行標記，3’端采用熒光淬滅基團TAMRA進行標記。具體序列參考歐盟公開發(fā)布的轉基因玉米T25轉化體特異性方法驗證報告［5］，見表1。

表1 Taqman探針實時PCR檢測引物和探針序列信息

2.2 方法

2.2.1 樣品DNA的提取

采用天根生化科技公司的植物DNA抽提試劑盒（離心柱型）對樣品的基因組DNA進行提取，具體過程見試劑盒說明書。

2.2.2 紫外分光光度法檢測提取DNA純度

用1×TE0.1做空白采用紫外分光光度計進行測定A260、A280和A320的紫外吸收值，然后將提取的DNA溶液分別測定A260、A280和A320下的紫外吸收值。以A320作為背景吸收計算出樣品DNA溶液在260 nm、280 nm處的紫外吸收值。

2.2.3 熒光染料法測定DNA濃度

為能準確測定DNA的濃度，本實驗采用熒光染料法，即PicoGreen dsDNA定量試劑盒法測定提取DNA溶液的濃度。實驗中使用的熒光染料P7589能特異性的結合雙鏈DNA，因此可以特異性測定雙鏈DNA的濃度，受單鏈DNA、RNA和蛋白質的影響較小。

2.2.4 實時熒光定量PCR擴增

經過純度鑒定后提取的DNA進行實時熒光定量PCR擴增，擴增所用的引物探針及濃度見表1。擴增程序為：95℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，50個循環(huán)。

2.2.5 標準曲線的制作

將基因組DNA標準物質用熒光染料法測定濃度，計算溶液中含有的基因組的拷貝數，然后采用梯度稀釋法對基因組DNA溶液進行稀釋。分別稀釋5個梯度，作為標準溶液。取5μL已稀釋的基因組DNA標準溶液，按照本文第2.2.4節(jié)中描述的熒光定量PCR條件進行擴增。擴增后得到以拷貝數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標的標準曲線。

式中，［DNA］為測定的基因組溶液的質量濃度，g／L；MW為基因組的分子量大小，其中基因組大?。▔A基對）為2 500×106。

定量PCR的擴增效率計算式為

E為擴增效率；ks為標準曲線的斜率。

3 實驗結果

3.1 方法驗證

3.1.1 樣品DNA的質量檢查

根據OD260／OD280的比值，確定提取DNA的純度，當比值為1.8～2.0之間說明樣品DNA質量滿足實驗要求。轉基因玉米T25標準物質樣品提取DNAA260／A280比值均處在1.8～2.0之間，見表2，表明提取的DNA質量純度符合要求。

表2 轉基因玉米T25基因組DNA質量分析（n＝5）

3.1.2 標準曲線參數

對其線性擴增效率和線性相關性進行評價。PCR擴增產生的標準曲線的斜率必須在－2.9～－3.7，線性相關系數＞0.985，見表3，因此斜率和線性相關系數均滿足要求［7］。

表3 轉基因玉米T25內、外標準基因定量PCR擴增效率和線性相關系數

3.1.3 重復性

在對建立的轉基因玉米T25定量PCR檢測方法內、外標準基因的擴增效率，線性相關系數等參數進行驗證后，用建立的定量PCR方法對轉基因玉米T25基體A、B、C 3個梯度水平的樣品進行了定量分析。結果顯示，所有樣品定量分析的相對標準偏差RSD在25%之內，說明轉基因玉米T25定量PCR方法的重復性能夠滿足定量的要求［7］，可用于該基體物質的定值。

表4 轉基因玉米T25定量PCR檢測重復性（n＝9）

3.2 協同實驗驗證

3.2.1 協同實驗結果

上述方法經過方法驗證可用于轉基因玉米T25基體標準物質定值，選擇有資質的實驗室使用該方法對轉基因玉米T25基體標準物質進行協同實驗。每個參與協同實驗的實驗室對3個待測定樣品進行3次重復測定，每次重復測定至少設置3個平行。

此次協同實驗中選擇了7家實驗室，7家實驗室使用了不同的定量PCR儀器、不同的儀器分析軟件以及不同的基線設定方法。實驗室使用的定量PCR儀器主要是ABI系列，Rotor-Gene 3000A和bio-rad系列定量PCR儀。基線和閾值的設置除1家實驗室外，其余6家均采用自動設置。從各實驗室定量PCR標準曲線參數可以看出，不同的PCR儀器均得到了較好的擴增效率和線性相關系數，進一步說明轉基因玉米T25定量PCR體系適用于不同的PCR儀器，具有較好的穩(wěn)定性。

各實驗室定量PCR的線性相關系數和擴增效率以及定量標準曲線斜率的計算結果見表5，由表中結果可以看出，7個實驗室構建的定量標準曲線的內標準基因擴增效率在0.87～0.96之間，平均值為0.93，線性相關系數均大于0.99。外標準基因擴增效率在0.83～0.93之間，平均值為0.89，線性相關系數均大于0.99。說明各家實驗室所構建的轉基因玉米T25定量PCR標準曲線符合定量要求，具有較好的擴增效率和線性相關系數。

表5 各實驗室定量PCR的擴增效率和線性相關系數

3.2.2 標準物質量值

根據一級標準物質研制規(guī)范［8］中對采用多個實驗室合作定值時數據處理要求，首先考察各實驗室全部測量數據是否服從正態(tài)分布，經統(tǒng)計分析，3個水平的基體標準物質測定結果均服從正態(tài)分布。然后將各實驗室測量結果的平均值視為一組新的數據，再對各家平均值采用格拉布斯準則進行離群值檢驗［9］，經檢驗并沒有發(fā)現離群值。最后用科克倫（Cochran）法檢查各組數據之間是否等精度［10］，經檢驗各家數據等精度，因此計算其總平均值及其標準偏差，所得算術平均值即為該標準物質的標準值，見表6。

表6 多家協同實驗結果

3.2.3 不確定度評定

轉基因玉米T25定值結果的不確定度由兩部分組成，第一部分是定值結果的A類標準不確定度uA，第二部分是定值方法的B類標準不確定度uB。

A類不確定度uA是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出的不確定度。通過分析，各實驗室的數據平均值等精度，因此A類不確定度的具體計算方法為：

對標準物質的特性量進行測定時，由m個實驗室進行測定，每個實驗室測定平均值為測定數據服從正態(tài)分布，間等精度為

B類不確定的主要來源包括：（1）移液器帶來的不確定度；（2）標準溶液系列稀釋帶來的不確定度；（3）標準物質引入的不確定度。由標物證書可知，標準物質的不確定度可以忽略，因此B類不確定評定僅考慮前2個因素。

表7 轉基因玉米T25基體標準物質的標準值及不確定度（%）

4 總 結

對轉基因玉米T25定量PCR方法進行了方法驗證研究，測試了定量標準曲線、線性相關性、PCR擴增效率、重復性等主要技術參數，經過驗證，該方法滿足標準物質定值要求。組織了7家實驗室對轉基因玉米T25 A、B、C 3個水平的基體標準物質進行了協同定值，對多家定值的數據進行了統(tǒng)計分析。經分析得出，轉基因玉米T25 A、B、C 3個水平的轉基因質量分數分別為0.99%、1.61%和10.38%，擴展標準不確定度（K＝2）分別為0.22%、0.38%和2.3%。

［1］ AOCS0306-H3＋Certificate［EB］.https：／／secure.aocs. org／crm／files／0306H3-Certificate.pd f，2011-08-05.

［2］ R?nning SB，Va?tilingom M，Berdal K G，etal.Event specific real-time quantitative PCR for genetically modified Bt11 maize（Zea mays）［J］.EuropeanFood ResearchTechnology，2003，216（4）：347－354.

［3］ Holst-Jensen A，R?nning S B，L?vseth A，etal.PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms（GMOs）［J］.Analalyticaland BioanalyticalChemistry，2003，375（8）：985－993.

［4］ Cankar K，Stebih D，Dreo T，etal.Critical points of DNA quantification by real-time PCR—effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of geneticallymodified organisms［J］.BMCBiotechnology，2006，6（14）：37－51.

［5］ Mazzara M，Grazioli E，Savini C，etal.Event-specific method for the quantitation of maize line T25 usin realtime PCR，validation report［R］.EUR 21826 EN，2005.

［6］ 于亞東.化學分析的方法確認［M］.北京：中國計量出版社，2009.

［7］ ENGL.Definition of minimum performance requirements for analyticalmethods of GMO testing［R］.EUR 23696 EN，2008.

［8］ JJG 1006—94，一級標準物質技術規(guī)范［S］.

［9］ ISO Guide 35：2006，Reference materials—General and statistical princip les for certification［S］.

［10］ JJF 1343—2012，General and statistical principles for characterization of referencematerials［S］.

Characterizing on Genetically Modified T25 Maize Line Matrix Reference Material

DONG Lian-hua1， LILiang1， ZHOU Yun-long2， CAO Ying-Long3，SHEN Ping2， LU Chang-ming3， WANG Jing1， LIU Zhang-lan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing100013，China；
2.Science and Technology Development Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100122，China；
3.Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Wuhan，Hubei430062，China）

To validate the key parameters of the real time PCR method for GM maize T25，7 different laboratories are chosen to assign the reference values of three different GM content matrix reference materials by using the same method.Although different types of instruments are used by different labs，the standard curve generated by each lab is comparable which indicated that thismethod shows a good reproductablity.After statistically analyzing the data gained from seven labs，the totalmeans are assigned to be the reference values.The reference values and expanded uncertainties（k＝2）for threematrix GM referencematerial are 1.17%±0.22%，2.17%±0.38%and 9.81%±2.30%.

Metrology；Geneticallymodified maize；T25；Matrix referencematerial；Real time quantitative PCR

TB99

A

1000-1158（2014）01-0087-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．01．18

2011-09-05；

2013-05-20

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2008ZX08012-003）；科技支撐項目（2008BAK41B01）

董蓮華（1981－），河北淶水，中國計量科學研究院助理研究員，博士，主要從事微生物轉基因核酸標準物質研究。lianhuadong＠gmail.com