袁玉輝，劉顯軍，楊柳，陸贏，官春云，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，湖南 長沙410128)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有簡單、快速、高效的特點(diǎn)，且整合的外源基因多為單拷貝，轉(zhuǎn)化獲得的單拷貝植株遺傳穩(wěn)定性好，多符合孟德爾遺傳定律[1]，能直接為遺傳育種提供新種質(zhì)，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中被廣泛應(yīng)用。油菜遺傳轉(zhuǎn)化多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，適宜的外植體包括下胚軸、子葉柄、莖段、小孢子等[2–5]。油菜子葉柄和下胚軸外植體具有取材簡便、易于再生、生長快速等優(yōu)點(diǎn)[6]，因此子葉柄和下胚軸是油菜遺傳轉(zhuǎn)化的首選外植體。目前，已建立了甘藍(lán)型油菜的相對穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系[6–7]，但還沒有建立起相對穩(wěn)定且高效的芥菜型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系，原因有玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重和轉(zhuǎn)化陽性率低等[8–12]問題。本研究擬優(yōu)化影響芥菜型油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素，包括愈傷誘導(dǎo)、芽分化及生根培養(yǎng)3個(gè)階段的激素和硝酸銀配比，以建立芥菜型油菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為芥菜型油菜轉(zhuǎn)基因研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，含有標(biāo)記基因NPTII和報(bào)告基因GUS的雙元載體pBI121質(zhì)粒由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)桿菌在含有50 mg/L利福平(Rif)和50 mg/L卡那霉素(Kan)的YEP固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28 ℃。挑取單菌落接種于50 mL YEP液體培養(yǎng)基(50 mg/L Rif, 50 mg/L Kan)中，于28 ℃、200 r/min的搖床上振蕩過夜培養(yǎng)(16～24 h)，當(dāng)菌液OD600nm值約為0.6時(shí)，4 ℃、4 000 r/min離心8 min，收集菌體，加入等量的MS培養(yǎng)液重懸菌體，調(diào)整OD600nm至0.3～0.6，并添加100 μmol/L 乙酰丁香酮(AS)用于浸染。

1.2 外植體的獲取

外植體供體材料為芥菜型油菜(Brassica juncea L.Czern and Coss)品種‘四川黃籽’，來源于劉忠松課題組培育的高代自交系[13]。選取飽滿種子，無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s 后，用0.1%氯化汞浸泡12 min滅菌，用無菌水沖洗3次后接種于發(fā)芽培養(yǎng)基(表1)中培養(yǎng)。(22±2)℃暗培養(yǎng)4 d，再光照培養(yǎng)2 d，用解剖刀切下完整的下胚軸(5～10 mm)作為外植體。

表1 芥菜型油菜下胚軸誘導(dǎo)再生各階段的培養(yǎng)基組成Table 1 Component of medium used in each stage for inducing the regeneration of hypocotyls of Brassica juncea

1.3 外植體預(yù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將下胚軸接種于含有不同濃度生長素(NAA、IAA、2,4–D)和細(xì)胞分裂素(6–BA)組(表2)的預(yù)培養(yǎng)基(表1)中預(yù)培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)移到與預(yù)培養(yǎng)基含相同激素組合的共培養(yǎng)基(添加100 μmol/L AS)上暗培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)入含有3 mg/L 6–BA + 5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計(jì)出愈率，20 d后統(tǒng)計(jì)芽再生率。預(yù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)及分化培養(yǎng)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)含 20個(gè)下胚軸，結(jié)果取平均值。出愈率＝帶綠色愈傷的外植體數(shù)/外植體數(shù)×100%，芽再生率＝再生不定芽的外植體數(shù)/外植體數(shù)×100%。選取芽再生率最高的預(yù)培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)愈傷組織用于下一步試驗(yàn)。所有的外植體均保持在(22±2)℃下生長、光周期為16 h/8 h(光/暗)，光強(qiáng)為2 000 lx(冷白日光燈管)。

表2 芥菜型油菜下胚軸預(yù)培養(yǎng)基中處理激素組合Table 2 The hormone combination in the pre–culture medium for Brassica juncea hypocotyls

1.4 浸染與共培養(yǎng)

將預(yù)培養(yǎng)的下胚軸用農(nóng)桿菌菌液振蕩浸泡5 min，再接種到共培養(yǎng)基中避光共培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)基見表1，培養(yǎng)條件同上所述。

1.5 脫菌與分化培養(yǎng)

將經(jīng)過共培養(yǎng)的下胚軸用無菌水清洗3次，用含500 mg/L羧卞青霉素(Carb)的MS培養(yǎng)液100 r/min振蕩洗滌30 min，轉(zhuǎn)入含有不同濃度配比的6–BA +AgNO3的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為探討6–BA濃度對芽再生和AgNO3濃度對下胚軸芽再生的影響，將脫菌后的下胚軸分別接種到含有2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/L 6–BA分化培養(yǎng)基(含500 mg/LCarb)中培養(yǎng)，從中選擇芽再生率最高的含6–BA的分化培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基中添加3、4、5、6、7 mg/L AgNO3，用于下胚軸的下一步培養(yǎng)。

1.6 生根培養(yǎng)

當(dāng)分化芽長約2 cm時(shí)，切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。為研究激素配比對生根的影響，使用含以下7種激素組合的生根培養(yǎng)基：①1/2 MS；②1/2 MS +1.5 mg/L IBA；③1/2 MS +2.0 mg/L IBA；④1/2 MS +2.5 mg/L IBA；⑤1/2 MS +2.5mg/L IBA+0.05 mg/L NAA；⑥1/2 MS +2.5 mg/L IBA+0.10 mg/L NAA；⑦1/2 MS +2.5mg/L IBA+0.1 5mg/L NAA。光周期為12 h/12 h(光/暗)。培養(yǎng)18 d后統(tǒng)計(jì)生根率并觀察根的形態(tài)，每次處理5個(gè)再生芽，設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。生根率＝生根的芽數(shù)/總芽數(shù)×100%。

1.7 PCR檢測

待根生長20 d左右，煉苗5 d，再將試管苗移栽到蛭石里，待根舒展固定后連同蛭石一起移栽到缽?fù)晾?。再生苗長到五葉期后，用CTAB法提取單株DNA進(jìn)行PCR電泳檢測。用pBI121表達(dá)載體的選擇標(biāo)記基因NPTII特異引物(NPTⅡF：5′–CGGCTATG ACTGGGCACAACAGACAAT–3′；NPTⅡR：5′–AG CGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAA–3′)進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為686 bp。10 μL的PCR擴(kuò)增體系含有1 μL10×Buffer，正反向引物各1 μL(3.29 mmol/L)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，0.2 μL Taq酶(5 U/μL)，2 μL模板(50 ng/μL)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.8 GUS染色檢測

將浸染后脫分化培養(yǎng)10 d的下胚軸、抗性芽和PCR檢測陽性植株的幼嫩葉片浸泡在GUS染色液中，37 ℃溫育過夜，再轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中脫色，直到陰性材料呈白色，在體視顯微鏡下觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)基中激素配比對愈傷誘導(dǎo)的影響

圖1 預(yù)培養(yǎng)基中不同激素配比對芥菜型油菜下胚軸愈傷誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of different hormone combinations in pre–culture medium on callus induction for hypocotyls of Brassica juncea

圖2 預(yù)培養(yǎng)基中芥菜型油菜下胚軸愈傷組織的形態(tài)Fig.2 The morphology of callus on pre–culture medium induced from hypocotyls of Brassica juncea

當(dāng)不添加任何生長素時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織很小，且出愈率僅為6.67%～13.33%(圖1)。當(dāng)添加0.5或1.0 mg/L NAA時(shí)出愈率達(dá)到66.67%～100%(圖1)，但有大量白色根毛生成，呈板狀根(圖2)，愈傷疏松膨大，抑制了芽的形成。添加0.5和1.0 mg/L 6–BA能促進(jìn)下胚軸的生長及愈傷生成(圖2)。當(dāng)用IAA處理時(shí)，單獨(dú)使用IAA導(dǎo)致大量發(fā)狀根的生成(圖2)，且出愈率為0。如果添加6–BA，僅0.5 mg/L IAA＋0.5 mg/L 6–BA組合有46.67%外植體生成愈傷，且伴隨有板狀根；其余的激素組合愈傷率僅為6.67%～13.33%，且愈傷很小，不轉(zhuǎn)綠。2,4–D的誘導(dǎo)愈傷的效果優(yōu)于NAA和IAA，添加2,4–D后出愈率達(dá)到 73.33%～100%，且愈傷多呈黃綠色，疏密程度適中，易分化成芽，當(dāng)2,4–D的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷再生率達(dá)到 100%(圖 1)。6–BA的添加導(dǎo)致根毛的增多，而出愈率反而減少(圖1)，因此，預(yù)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的2,4–D適合下胚軸分化形成愈傷組織。

2.2 分化培養(yǎng)基中激素配比對芽再生的影響

下胚軸轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中1周后切口處開始膨大并轉(zhuǎn)綠，愈傷組織繼續(xù)生長，在第12天左右長出不定芽。當(dāng)分化培養(yǎng)基中6–BA質(zhì)量濃度低于3 mg/L時(shí)，隨著6–BA濃度的升高芽再生率和芽叢數(shù)都增加(表3)；當(dāng)6–BA質(zhì)量濃度為3 mg/L 時(shí)，芽再生率最高，達(dá)20%，平均芽叢數(shù)為1.72個(gè)(芽叢形態(tài)見圖3)；但隨著6–BA質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，芽再生率反而降低，而6–BA質(zhì)量濃度為2.5、3.0、4.0 mg/L時(shí)芽叢數(shù)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合分析認(rèn)為，分化培養(yǎng)基中最適宜芥菜型油菜‘四川黃籽’下胚軸芽分化的6–BA質(zhì)量濃度為3 mg/L。

表3 芥菜型油菜下胚軸愈傷組織在含不同濃度6–BA的分化培養(yǎng)基中芽的再生率及芽叢數(shù)Table 3 The shoot regeneration rate in differentiation medium with different concentration of 6–BA from hypocotyls of Brassica juncea

圖3 芥菜型油菜下胚軸再生芽的芽叢形態(tài)Fig.3 The bud morphology of shoot regenerated from hypocotyls of Brassica juncea

2.3 AgNO3濃度對芽再生的影響

由表4可知，在含有3 mg/L 6–BA的分化培養(yǎng)基中添加AgNO3能提高芽再生率。當(dāng)AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L 時(shí)，芽再生率達(dá)28.33%，比沒有添加AgNO3時(shí)提高了41.65%，并與其他濃度的處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芽叢數(shù)則在AgNO3質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)差異顯著，達(dá)到最大值(2.28個(gè))，其余組合芽叢數(shù)約為1.70個(gè)。綜合比較，分化培養(yǎng)基中適宜的6–BA和AgNO3的組合為3 mg/L 6–BA＋5 mg/L AgNO3。在此組合下，有25%以上的愈傷能分化成芽，且有1～2個(gè)健壯芽，而不添加AgNO3的組合誘導(dǎo)不出健壯芽。

表4 芥菜型油菜下胚軸在含不同濃度AgNO3的分化培養(yǎng)基中芽的再生率及芽叢數(shù)Table 4 The shoot regeneration rate on differentiation medium of different concentration AgNO3 from hypocotyls of Brassica juncea

2.4 生根培養(yǎng)基中激素配比對根再生的影響

不定芽轉(zhuǎn)移到不含任何激素的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后能生根，生根率為20%，主根為6條左右；而在含1.5和2.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，不定芽培養(yǎng)12、13 d便開始生根，但主根少、不粗壯；在含2.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，不定芽培養(yǎng)12 d開始生根，生根率達(dá)到100%，且根多、粗壯。添加不同濃度NAA的含有2.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中的主根比不加NAA的培養(yǎng)基中的根粗壯，且當(dāng) NAA質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時(shí)，生根所需時(shí)間縮短至11 d，且生根率為100%。芥菜型油菜再生芽在不同激素配比生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 d后根的形態(tài)見圖4，添加2.5 mg/L IBA和0.05 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根的效果較好。

圖4 芥菜型油菜再生芽在不同生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 d后根的形態(tài)Fig.4 The root morphology of regenerated shoot of Brassica juncea after 18 days of cultivation in different rooting medium

2.5 再生苗檢測

特異性PCR檢測結(jié)果(圖5)表明，21株卡那霉素抗性苗中有5株呈陽性，陽性率為23.80%。GUS染色結(jié)果表明，大部分的愈傷、抗性芽及5株P(guān)CR檢測呈陽性的再生苗葉片GUS染色都呈陽性(圖6)，說明這5株再生苗為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖5 T0代芥菜型油菜四川黃籽轉(zhuǎn)基因苗中NPTII基因的PCR電泳檢測Fig.5 Detection of NPTII gene in T0 generation transgenic Sichuan yellow seed Brassica juncea by PCR

圖6 GUS檢測結(jié)果Fig.6 Results for GUS staining

3 結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率受多重因素的影響，如植物基因型、外植體類型、浸染濃度與時(shí)間、激素的配比等[14]。本研究探討了芥菜型油菜‘四川黃籽’下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系中激素和硝酸銀配比對愈傷誘導(dǎo)、芽再生和生根的影響。結(jié)果表明，在基本培養(yǎng)基上添加1 mg/L 2,4–D進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)、添加3 mg/L 6–BA和5 mg/L AgNO3進(jìn)行分化培養(yǎng)、添加2.5 mg/L 6–BA和0.05 mg/L NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)的效果較好。

芥菜型油菜‘四川黃籽’下胚軸預(yù)培養(yǎng)基中添加1 mg/L 2,4–D效果較好，這與Ali等[15]研究結(jié)果不同。他們認(rèn)為甘藍(lán)型油菜下胚軸在含0.5 mg/L 2,4–D＋0.5 mg/L 6–BA的培養(yǎng)基中出愈率可達(dá)95%～96%。在分化培養(yǎng)基中添加AgNO3能促進(jìn)芽分化。本研究結(jié)果是當(dāng)分化培養(yǎng)基中含有3 mg/L 6–BA+5～6 mg/L AgNO3最適宜芥菜型油菜芽再生，而Zhang等[9]的研究表明含3 mg/L 6–BA+2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)芥菜型油菜芽再生率最高，而5 mg/L 6–BA+5 mg/L AgNO3最適合甘藍(lán)型油菜芽分化[16]，說明較低濃度的6–BA更有利于芥菜型油菜芽再生。Mehra等[10]和Deepak等[11]在誘導(dǎo)芥菜型油菜芽分化時(shí)，AgNO3的使用濃度為20 μmol/L，而Barfield等[8]使用質(zhì)量濃度為3.3 mg/L，這可能與品種不同有關(guān)。Sharma等[17]認(rèn)為在添加0.2 mg/L IAA的培養(yǎng)基中，芥菜型油菜Pusajaikisan芽分化較好；Kong[18]、Kamal[19]等認(rèn)為甘藍(lán)型油菜誘導(dǎo)芽分化時(shí)培養(yǎng)基中添加少量的NAA效果更好。但本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中一旦添加NAA或IAA就會(huì)導(dǎo)致大量根毛的生成，抑制了芽的再生，其原因還有待進(jìn)一步探究。前人一般用含2.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)芥菜型油菜生根[10–11]，本研究結(jié)果表明，芥菜型油菜在含2.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基中再生芽100%生根，而甘藍(lán)型油菜在含0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后再生芽100%生根[3]，甚至在不含任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d后也可100%生根[14]，說明再生芽誘導(dǎo)生根對培養(yǎng)基的要求可能存在基因型、外植體苗齡的影響。

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