張志仙，朱長志，何道根

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000)

目前，在青花菜(Brassica oleracea L. var italica)遺傳育種工作中，對(duì)自交系的鑒定與識(shí)別仍以傳統(tǒng)育種手段為主[1–2]。依據(jù)表型和經(jīng)驗(yàn)來篩選自交系易受到環(huán)境或者經(jīng)驗(yàn)不足影響而淘汰一些優(yōu)異的種質(zhì)資源。將分子標(biāo)記手段用于青花菜的遺傳研究已有報(bào)道[3–5]。這些研究在青花菜品種的指紋圖譜及品種多樣性評(píng)價(jià)方面具有重要作用[6]，但大部分是對(duì)市場(chǎng)已有青花菜品種進(jìn)行鑒別或?qū)ζ贩N之間的遺傳多樣性進(jìn)行分析[7–12]，對(duì)青花菜自交系遺傳多樣性的研究尚少。筆者以10份經(jīng)多年自交純化、整齊度較高的青花菜自交系為材料，采用ISSR(inter simple sequence repeats)分子標(biāo)記手段對(duì)這些材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)自交系花球的營養(yǎng)成分含量進(jìn)行測(cè)定，旨在篩選出營養(yǎng)含量高的特殊材料和綜合品質(zhì)較好的自交系材料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為 10份經(jīng)多年自交純化、整齊度較高的青花菜自交系(表 1)，均來自臺(tái)州。2011年 9月 13日在浙江省臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)播種育苗，1個(gè)月后定植于大棚，常規(guī)栽培管理。于全生育期觀察植株長勢(shì)、營養(yǎng)器官形態(tài)等特征，去除異株，以保證每份自交系材料的純度。

表1 青花菜自交系的植物學(xué)性狀Table 1 Description of botanical traits of ten broccoli inbred lines

1.2 青花菜自交系的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法[13]提取植株幼嫩葉片總DNA。提取的DNA用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，超微量分光光度計(jì)(Quawell，美國)測(cè)定其濃度和質(zhì)量，－20 ℃保存，備用。

1.2.2 ISSR–PCR擴(kuò)增

ISSR引物來源于哥倫比亞大學(xué)公布的 100條序列，去除退火溫度低于48 ℃或高于60 ℃的引物，共76條，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司合成。

ISSR–PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，包括 2 μL 10倍PCR 緩沖液，25 mmol/L Mg2+0.8 μL，20 ng/μL 模板 DNA 1 μL，10 μmol/L 引物 1 μL， 10 mmol/L dNTPs 0.4 μL 和 5 U/μL Taqase(上海生工生物技術(shù)工程有限公司)0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，Tm退火30 s；72 ℃延伸120 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，保持電泳儀電壓120 V，電泳45 min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用人工計(jì)帶方式記錄電泳圖中清晰且能重復(fù)擴(kuò)增出的條帶，在相同的遷移位置上，將有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，將數(shù)據(jù)輸入Excel 2003表格中，構(gòu)建(0,1)原始矩陣。

采用NTSYS–pc 2.10軟件Qualitative data程序進(jìn)行相似性系數(shù)計(jì)算，用 UPGMA法(非加權(quán)平均法)生成聚類分析圖。

1.3 花球營養(yǎng)成份含量的測(cè)定

1.3.1 測(cè)定指標(biāo)及方法

于花球采收期挑選生長健康、花球成熟度一致的植株，取花球中部的小花枝洗凈，105 ℃殺青 2 h，70 ℃烘干至恒重，用失重法測(cè)定其含水量?；ㄇ蚩扇苄怨绦挝锖坑檬殖质秸酃鈨x測(cè)定；葉綠素含量用80%丙酮提取，分光光度法測(cè)定；可溶性蛋白質(zhì)含量采用Brandford法測(cè)定；維生素C含量采用碘量法測(cè)定；可溶性還原糖含量采用2,5–二硝基水楊酸法測(cè)定。所有測(cè)定均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用DPS 7.05進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜自交系的遺傳多樣性

以10份青花菜自交系為材料，從76條ISSR引物中共篩選出 15條可擴(kuò)增出清晰條帶且重復(fù)性好的引物(表2)用于青花菜自交系遺傳多樣性分析。15條引物共擴(kuò)增出95條帶，其中多態(tài)性條帶75條，多態(tài)性比例為78.95%。單條引物擴(kuò)增的條帶為2 ～12條，平均6.3條，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為200～1500 bp，其中以400～900 bp的條帶居多(圖1)。結(jié)果表明，從10個(gè)青花菜自交系的7份材料中擴(kuò)增出11個(gè)材料特征帶，其中，N614在引物UBC808擴(kuò)增圖譜的420 bp處、N437在UBC880的900 bp處、N364在UBC807的850 bp處、N237在UBC810的900 bp處、N622在UBC810的300 bp處分別存在1條材料特征性帶。N279在 UBC889的 650 bp處(圖1–B)、在UBC817的600 bp和330 bp處存在材料特征性條帶。N318在 UBC810的 500 bp處、在UBC888的650 bp處和在UBC889的800 bp(圖1–B)處存在3條特征性條帶。

表2 用于青花菜自交系遺傳多樣性分析的ISSR引物Table 2 Primers used for ISSR analysis of the ten broccoli inbred lines

圖1 引物UBC816(A)和UBC889 (B)的ISSR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretograms of amplified by primers UBC816 (A)and UBC889 (B)

2.2 青花菜自交系的聚類分析結(jié)果

以10份自交系材料在95個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)組成(0，1)原始矩陣，用 NTSYS軟件進(jìn)行遺傳相似性分析的結(jié)果 (圖2)顯示，各自交系之間的遺傳相似系數(shù)為0.557 9～0.852 6，平均相似系數(shù)為0.703 2，其中材料N244和N256的相似系數(shù)最大，為0.852 6，材料N437和N244的相似系數(shù)最小，僅為0.557 9。

采用UPGMA聚類法，以相似系數(shù)0.63為臨界值，10份青花菜自交系可聚為2類(A和B)：A類包含N237、N364等8個(gè)自交系，這8個(gè)成員又可以分為 4個(gè)亞類(相似系數(shù)臨界值為 0.76)，其中N237、N364、N244、N256為第1亞類，N622和N628為第2亞類，N614和N279分別組成第3、4亞類；B類包括自交系材料N318和N437。

圖2 青花菜自交系的聚類分析結(jié)果Fig. 2 Dendrogram of cluster analysis for ten broccoli inbred lines

2.3 花球的營養(yǎng)成分含量

對(duì)青花菜自交系花球6項(xiàng)營養(yǎng)成分含量的分析結(jié)果顯示，6項(xiàng)營養(yǎng)成分含量的變異系數(shù)有明顯差異。其中，維生素 C含量的變異系數(shù)最大，達(dá)55.43%，其余由大到小依次為總?cè)~綠素含量(40.01%)、可溶性蛋白質(zhì)含量(33.21%)、可溶性還原糖含量(29.17 %)和可溶性固形物含量(11.63%)，含水量的變異系數(shù)最小，僅為1.02%。

表3結(jié)果顯示，各自交系材料花球葉綠素含量間的差異有的達(dá)極顯著水平，其中，材料 N237、N244和N318的花球葉綠素a含量、葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量均高于其他材料。N364和N437的花球總?cè)~綠素含量最低，僅為N237的36%。青花菜各自交系花球含水量保持在 86.51%～88.81%，N256和N364的花球含水量最高，分別為88.62%和 88.81%。青花菜自交系間花球維生素 C含量的差異有的達(dá)極顯著水平。N256、N244和N237的花球維生素C含量明顯高于其他自交系，其中N256和N244的維生素C含量分別達(dá)1.87、1.53 mg/g，分別是N622的7.19倍和5.88倍。青花菜自交系花球中的可溶性蛋白質(zhì)含量最高可達(dá) 29.28 mg/g(N622)，最低僅為5.39 mg/g (N256)?；ㄇ蚩扇苄赃€原糖含量在各自交系間的差異有的達(dá)極顯著水平。N437花球的可溶性還原糖含量最高，達(dá)到 30.48 mg/g，N256的含量最低，僅為11.23 mg/g?？扇苄怨绦挝锖孔罡叩那?個(gè)自交系材料為N614、N244和N318，含量最低的為N364和N437。

表3 花球的含水量、葉綠素、維生素C、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性還原糖和可溶性固形物含量Table 3 Content of water, chlorophyll, vitamin C, soluble proteins, soluble reducing sugars and soluble solids in the curds of broccoli inbred lines

3 結(jié)論與討論

以10份青花菜自交系為材料，通過15條ISSR引物擴(kuò)增獲得95條帶，多態(tài)性比例為78.95%，其中N364、N614等7份自交系擴(kuò)增得到了11條特征性帶，表明ISSR技術(shù)可以從分子水平上揭示各個(gè)自交系的基因組差異。與此前對(duì)青花菜的遺傳多樣性研究結(jié)果[4,9]相比，本試驗(yàn)中每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)及總條帶數(shù)均偏少，這主要是因?yàn)榇饲暗难芯恐饕郧嗷ú穗s交品種為試驗(yàn)材料。這些材料結(jié)合了父本和母本雙方的基因多態(tài)性，而本試驗(yàn)中使用的自交系材料經(jīng)過多代自交后已基本純合，基因多態(tài)性較弱。

在植物親緣關(guān)系研究中，相似系數(shù)越大，材料間的親緣關(guān)系也越接近。本研究中各自交系之間的相似系數(shù)為0.557 9～0.852 6，表明青花菜自交系的遺傳基礎(chǔ)狹窄，這與 Lu等的推論[9]一致。通過UPGMA法聚類分析，10個(gè)青花菜自交系聚為2類(A、B類)：A類中，N244與N364、N244與N256的遺傳相似性最高，相似系數(shù)分別達(dá) 0.842 1和0.852 6，說明這些材料極可能具有相同的遺傳背景；B類包括自交系N318和N437，相似系數(shù)僅為0.673 7，遺傳多樣性較為豐富。

雜種優(yōu)勢(shì)形成的先決條件是父本和母本之間存在差異，即基因型差異和基因多態(tài)性。在雜交組配中，兩親本的相似性低，得到強(qiáng)雜交優(yōu)勢(shì)組合的可能性越大，反之亦然，因此，通過對(duì)自交系材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，再結(jié)合田間表現(xiàn)，能夠更準(zhǔn)確地對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，減少雜交親本選配上的盲目性，增加目的性。通過常規(guī)選育方法并結(jié)合分子生物學(xué)手段來創(chuàng)造特異的種質(zhì)資源，一直是植物學(xué)家和育種學(xué)家研究的重點(diǎn)之一[14–16]。本試驗(yàn)中對(duì)青花菜自交系花球的營養(yǎng)成分含量分析結(jié)果表明，除含水量外，其余5種物質(zhì)在各自交系之間的變異程度均大于10%，說明各材料的營養(yǎng)成分含量之間存在明顯差異；材料N256的維生素C含量最高，達(dá)1.87 mg/g，極顯著高于其他9份自交系材料，而N628、N279和N237各項(xiàng)綜合指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果均較理想。這些材料對(duì)選配高營養(yǎng)青花菜品種具有重要的利用價(jià)值。

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