薛麗君，邢虎成,2*，馬艷玲

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南省種質(zhì)資源創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙410128)

自20世紀(jì)初以來，在各種作物上已先后發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象。利用雄性不育已經(jīng)生產(chǎn)了水稻、棉花、油菜、甘藍(lán)等作物的雜交種[1–4]。中國苧麻雄性不育研究始于20世紀(jì)60年代[5]。目前，發(fā)現(xiàn)有2種雄性不育類型：①由細(xì)胞核控制的雄性不育[6]；②核–質(zhì)互作雄性不育[7]。

劉飛虎等[8]報道了蛋白質(zhì)和氨基酸等的差異可能是導(dǎo)致苧麻雄性不育的原因。宋軍等[9–10]報道物質(zhì) (可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸)代謝和同工酶代謝差異是不育系、恢復(fù)系之間的主要差異。段繼強(qiáng)等[11]報道不育系atpA 基因的序列變異和(或)異常表達(dá)可能與苧麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育關(guān)系密切。

筆者所在課題組對黑皮蔸MS系列和大葉綠MS系列等21份雄性不育種質(zhì)進(jìn)行了田間觀察、花粉活力測定、自交種子發(fā)芽試驗和天然雜交種子發(fā)芽試驗，結(jié)果將湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所收集的21份苧麻種質(zhì)歸為4類，即雄花萎縮型、雄花不開裂型、花粉不育型、待定型[12]。在此基礎(chǔ)上，筆者對雄花萎縮型、雄花不開裂型、花粉不育型雄性不育株的花芽分化和花藥發(fā)育過程進(jìn)行觀察，并與可育材料進(jìn)行比較，分析不育系的花藥敗育時期和發(fā)育特點(diǎn)，旨在為探索苧麻雄性不育的機(jī)理及今后將苧麻不育種質(zhì)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試苧麻

雄性不育材料雄花萎縮型種質(zhì)圓青5號、花被不開裂型種質(zhì)彎子苧麻和花粉不育型種質(zhì)黃小葉。雄性可育材料中苧1號。以上材料均來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗基地，栽培時間為3年以上，每種質(zhì)1小區(qū)，不設(shè)重復(fù)，常規(guī)管理。

1.2 方 法

1.2.1 取樣與固定

從孕蕾期開始取樣，直到開花為止，放于青霉素小瓶中，用FAA(50%乙醇89 mL+6 mL冰醋酸+5 mL福爾馬林+5 mL甘油)固定，于4 ℃冰箱中保存。每次取樣記錄花芽大小、取樣時間并給樣本編號(表1)。由于不同品種苧麻開花時間不同，因此本試驗是以花芽長度作為取樣的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 石蠟切片觀察

固定的材料采用常規(guī)石蠟切片法制成永久切片，切片厚度9 μm，番紅–固綠染色，中性樹膠封片，在奧林巴斯BX51型光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

表1 取樣時間及花芽長度Table 1 Sampling time and flower bud size

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性可育中苧1號雄花的形成與發(fā)育

雄花花芽由莖下部葉腋的副芽形成。雄花花芽分化分為花序分化期、花被形成期、雌雄蕊形成期和雌雄蕊分化期。花序分化時，副芽頂端細(xì)胞分裂加快，使尖端橫徑加寬，形成花序原始體，它可分化出花序軸和許多分支軸，在花軸分支的周圍會分化出5～9個小突體，即為雄花的原始體(圖1–A)。繼續(xù)分化，花的原始體繼續(xù)膨大，其基部產(chǎn)生花被原基突起，逐漸向花的頂部伸長，形成花蕊的一種保護(hù)機(jī)構(gòu)(圖1–B)。當(dāng)花被伸長并向頂部包圍時，呈圓錐狀的花原基中央突起就是雌、雄原始體，以后圓錐狀的中央突起形成雌蕊原始體，而圓錐狀的基部出現(xiàn)4個小突起，即為雄蕊原始體(圖1–C)。苧麻雄花中的雌蕊珠心原始體，并不隨著整個花的發(fā)育繼續(xù)分化，而是在進(jìn)一步的發(fā)育過程中逐漸萎縮消失，因此成熟后子房壁內(nèi)只是一個空腔(圖1–D)。

雄蕊原基最初呈小丘狀，隨后伸長成棒狀，外形上并沒有花藥和花絲的變化。繼續(xù)發(fā)育，花藥呈現(xiàn)4個或2個瓣狀結(jié)構(gòu)，每瓣發(fā)育成1個花粉囊(圖1–E)。從縱切面看，花藥內(nèi)部已發(fā)生分化，外面為表皮層，花藥里面為孢原細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)較濃，染色較深(圖1–F)?？恐休S的幾列細(xì)胞，是藥隔的原始細(xì)胞，在花粉粒之間組成藥隔，內(nèi)具維管束，被染成紅色(圖11–G)?；ㄋ幏只钔鈱邮潜砥ぜ?xì)胞，表皮內(nèi)的孢原細(xì)胞進(jìn)行平周分裂，產(chǎn)生中層、絨氈層和造孢細(xì)胞3層。造孢細(xì)胞通過幾次有絲分裂形成數(shù)量較多的花粉母細(xì)胞，再經(jīng)減數(shù)分裂成為四分體。當(dāng)花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂時，中層細(xì)胞會逐漸消失，絨氈層的細(xì)胞逐漸長大，四分體形成不久后，花粉母細(xì)胞的壁開始破裂，花粉粒從中釋放出來，絨氈層細(xì)胞溶解(圖1–H)。花藥成熟后，花粉囊壁僅為一層表皮，其余各層消失，囊中分散的花粉粒即散發(fā)出去。

圖1 中苧1號花芽發(fā)育情況(×40)Fig.1 Development of flower bud of Zhongzhu No.1 (×40)

2.2 雄花萎縮型園青5號雄花的形成與發(fā)育

雄花萎縮型園青5號花芽長至0.3 cm時，已發(fā)育到雌雄蕊分化期(圖2–A)，而可育中苧1號的花芽長至0.4 cm時還處于花序分化期，可見，雄花萎縮型苧麻品種的花芽發(fā)育較快。雌蕊原始體形成退化，即雌蕊在發(fā)育過程中會退化消失，形成空腔(圖2–B)，這與可育系材料中苧1號的相同。

圖2 雄花萎縮型園青5號苧麻花芽發(fā)育情況(×40)Fig.2 Flower bud development for the male flowers atrophic type Yuanqing No. 5 ramie (×40)

雄花萎縮型園青5號在花芽長至0.8 cm時，雌蕊、雄蕊都在正常發(fā)育，雄花已有花藥和花絲的變化(圖2–B)；花芽在分化出花絲和花藥后就停止生長或生長極其緩慢，花芽長至1.4～1.5 cm，花粉囊形成開始萎縮變形(圖2–C)，花藥染色逐漸變淺(圖2–D)，由于固綠主要用于細(xì)胞質(zhì)的染色，說明孢原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)在變??；花藥和花絲的表皮細(xì)胞位于花藥邊緣(圖2–E)。最后花藥萎縮干癟，花粉囊逐漸消失，形成中空的結(jié)構(gòu)，甚至消失而失去育性(圖2–F)。

2.3 花被不開裂型彎子苧麻雄花的形成與發(fā)育

花被不開裂型彎子苧麻花芽發(fā)育較中苧1號快，其花芽長至0.3 cm時雌、雄蕊已經(jīng)分化，花藥內(nèi)部已發(fā)生分化，表皮下的孢原細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)較濃、染色較深，有些花藥中可看到已有花粉囊形成，靠中軸的藥隔原始細(xì)胞清晰可見，其中維管束細(xì)胞被染成紅色(圖3–A)。

當(dāng)花芽長至0.7 cm時，花粉囊形成，花被內(nèi)側(cè)變黑，花被外側(cè)有木質(zhì)化現(xiàn)象并被染成紅色，這種花被的木質(zhì)化現(xiàn)象會導(dǎo)致在花粉成熟時花被無法開裂而造成雄性不育；雌蕊退化消失成空腔，這與中苧1號的相同，但花被不開裂型彎子苧麻退化的雌蕊會逐漸木質(zhì)化而被染成紅色(圖3–B)；有些花藥發(fā)育畸形或者萎縮干癟，未形成瓣狀結(jié)構(gòu)(圖3–C)，藥隔維管束不是位于中軸且面積較大(圖3–D)；有些花粉囊中產(chǎn)生的花粉粒會逐漸變黑(圖3–E)。當(dāng)花芽長至4.5 cm時，一些雄花花被部分木質(zhì)化而導(dǎo)致不能開裂散粉(圖 3–F)。

圖3 花被不開裂型彎子苧麻的花芽發(fā)育情況(×40)Fig.3 Flower bud development for male indehiscent type Wanzi ramie (×40)

2.4 花粉不育型黃小葉雄花的形成與發(fā)育

花粉不育型黃小葉花芽長至0.3 cm時已完成雄花花芽的分化，花藥中可看到花粉囊、維管束和藥隔。可見，花粉不育型黃小葉的花芽發(fā)育也比中苧1號的快。此時花藥呈瓣狀結(jié)構(gòu)，有2個花粉囊(圖4–A)。孢原細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)較濃，染色深，藥隔中維管束細(xì)胞被染成紅色(圖4–A)?；ㄑ块L至0.7 cm時花粉囊形成，花粉囊中已有花粉粒生成(圖4–B)，隨后持續(xù)在這一階段；當(dāng)花芽長至2.3 cm時，藥隔消失，花粉囊中的花粉粒顏色逐漸變深(圖4–C)；花芽長至3.8 cm時，花絲發(fā)育異常，花粉囊中花粉異常且數(shù)量很少(圖4–D)。黃小葉在形成花粉后，花粉囊壁直到花芽長至6.0 cm時都未破裂(圖4–E、F)。

從圖5可見，在黃小葉部分花藥發(fā)育過程中，從造孢母細(xì)胞時期開始出現(xiàn)花絲發(fā)育的異常膨大(圖5–A)，尤其是花絲與花藥連接處發(fā)生彎曲(圖5–B、C)，這可能導(dǎo)致黃小葉花粉發(fā)育不良而不育。小孢子母細(xì)胞時期花藥的表皮、中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞都存在分解現(xiàn)象(圖5–D)。在小孢子二分體時期，花藥內(nèi)部的絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)降解(圖5–E)。在四分體時期也可以看到花藥內(nèi)壁絨氈層細(xì)胞開始降解(圖5–F)，因此，推測黃小葉苧麻花粉不育是由于絨氈層和花絲發(fā)育異常導(dǎo)致。

圖5 黃小葉花絲和絨氈層的切片觀察結(jié)果Fig.5 Filaments and tapetum layer of Huangxiaoye

3 討 論

不同雄性不育材料的敗育時期不盡相同，從雄蕊分化到花粉粒成熟的各個時期均有可能[13–16]?；ㄑ糠只?jīng)歷苞片原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期、雄蕊瓣化期和雌蕊瓣化期[17–18]，而花粉發(fā)育經(jīng)歷孢原細(xì)胞、造孢細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞、四分體、單核小孢子、花粉等階段，在這一發(fā)育過程中任何一個階段出現(xiàn)異常都將產(chǎn)生敗育花粉，最終導(dǎo)致雄性不育。筆者研究的3個雄性不育苧麻敗育的時期都發(fā)生在花藥花絲形成以后，即在花粉發(fā)育階段。這與小麥[13]、亞麻[14]、蘿卜[15]、梨[16]等雄性不育材料敗育的時期相似。但熊少兵等[19]的研究發(fā)現(xiàn)苧麻雄性不育系GS14–1雄蕊發(fā)育受阻于雌雄蕊原基分化期或花藥形成初期，可能與取樣時間和花的大小有關(guān)。

絨氈層細(xì)胞為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[20]，并在減數(shù)分裂后適時分泌胼胝質(zhì)，使小孢子分離。絨氈層提前解體而無法給小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，會導(dǎo)致花粉失去育性，而在減數(shù)分裂后，絨氈層沒有適時的分泌胼胝質(zhì)使小孢子分離，也會導(dǎo)致花粉敗育[21]。本試驗中花粉不育型黃小葉小孢子敗育可能是花藥發(fā)育過程中絨氈層異常導(dǎo)致的。另外在開花時，花被上部展開，花絲彈直，將藥室彈開，花粉粒外揚(yáng)，在試驗中看到雄性不育苧麻黃小葉中花絲發(fā)育異常，這是否會導(dǎo)致苧麻雄性不育需要進(jìn)一步研究。

植物雄性不育系花藥中的維管束出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，在番茄、小麥、高粱、水稻等作物中均有報道，并認(rèn)為藥隔維管束出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象與花粉的敗育有一定關(guān)系。此外，維管束是植物體的輸導(dǎo)組織，如發(fā)育不良則直接影響物質(zhì)的交換和運(yùn)轉(zhuǎn)，從而影響小孢子的發(fā)育[22]。在本試驗中，觀察到花被不開裂型彎子苧麻的維管組織出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，可以認(rèn)為維管組織的異常現(xiàn)象是造成花粉敗育的原因之一。雄花萎縮型園青5號的敗育也可能與維管束異常有關(guān)。維管束異?？赡軐?dǎo)致花藥在發(fā)育過程中缺乏某種物質(zhì)而發(fā)生畸變。

本研究從形態(tài)學(xué)方面闡述了苧麻雄性不育材料雄花花芽的發(fā)育特點(diǎn)，要進(jìn)一步探索苧麻雄性不育的細(xì)胞學(xué)機(jī)理則要從絨氈層、細(xì)胞核、減數(shù)分裂、四分體等方面做更細(xì)致的觀察。

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