周 穎 章萍萍 孟少華 王 勇 袁懷波

(合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院，合肥 230009)

抗性淀粉，是一種抗消化性淀粉，即不能在人體小腸中被消化吸收但卻可以在大腸中被微生物分解的淀粉?？剐缘矸垡鸩秃笱堑牟▌虞^小，屬于低GI碳水化合物。此外抗性淀粉進入大腸內發(fā)酵產生的短鏈脂肪酸能夠降低結直腸癌的發(fā)病風險[1]。

目前制備抗性淀粉的方法主要有物理改性、化學改性和酶改性。阮少蘭等[2]采用酸變性和沸水浴法制備大米抗性淀粉，其得率為12.7%。吳紅引等[3]采用壓熱-酶法制備碎米抗性淀粉，其得率為16.8%，并利用X-射線衍射(X-RD)和電子掃描顯微鏡技術研究碎米抗性淀粉，得出其具有穩(wěn)定的晶體結構。Wang等[4]用玉米淀粉、瓜爾豆膠和檸檬酸的混合物擠壓制備抗性淀粉，其得率為16.2%。但是這些方法制得的抗性淀粉得率普遍較低，且來源于不同制備方法的抗性淀粉的抗消化能力無相關對比數據。本研究采用了α-淀粉酶與普魯蘭酶雙酶協同處理的方法制備大米抗性淀粉，優(yōu)化α-淀粉酶的最佳工藝條件，通過體外抗酶解試驗衡量其抗消化能力，并進一步采用差示掃描量熱儀(DSC)、電子掃描顯微鏡(SEM)和X-RD對雙酶、單酶、濕熱改性淀粉進行結構表征分析，旨在提高抗性淀粉的得率，增強抗性淀粉的抗消化能力，并且為抗性淀粉的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大米淀粉：金農生物有限公司；α-淀粉酶(4 000 u/g) 、糖化酶(100 u/mg)：上海Kayon生物技術有限公司；普魯蘭酶(2 000 u/mL)：銳陽生物；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Q 200差示掃描量熱儀：TA公司；XRF-1880 X射線熒光光譜儀：日本島津公司；JSM-6490LV 掃描電子顯微鏡：日本電子制造公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電氣有限公司；aR1140 電子分析天平：奧豪斯(上海)公司；SHY-2 水浴恒溫振蕩器：金壇市金城國勝實驗儀器廠；KA-1000 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；841Y—1 電熱恒溫烘箱：鹽城申信電熱機械有限公司；752 紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米抗性淀粉制備

雙酶法抗性淀粉的制備：準確稱取大米淀粉20 g，加蒸餾水調成淀粉含量為25%的淀粉水溶液，用檸檬酸緩沖液調節(jié)淀粉溶液pH為6.0后于80 ℃條件下水浴加熱20 min，糊化過程中需用攪拌機不停地攪拌淀粉以致糊化完全；冷卻至室溫后加入α-淀粉酶，α-淀粉酶的反應條件為pH 5.5，溫度70 ℃，時間20 min，酶用量4 u/g；調節(jié)pH至4.5，加入4 u/g的普魯蘭酶，在氣浴恒溫振蕩器中于46 ℃條件下反應12 h；接著將脫支后的淀粉溶液放置4 ℃冰箱中回生12 h；將回生后的淀粉溶液用冷凍離心機離心去除上清液；最后所得淀粉在60 ℃條件下干燥，研磨過200目篩，所得即為雙酶法制得的抗性淀粉。

單酶法[5]抗性淀粉的制備：糊化方法同上。糊化后的淀粉直接加入普魯蘭酶，方法同上。研磨、過篩即為單酶法制得的抗性淀粉。

濕熱法[6]抗性淀粉的制備：糊化方法同上。糊化后的淀粉沸水浴90 min；冷卻后置于4 ℃冰箱中回生12 h；最后干燥、研磨、過篩。

1.3.2 單因素試驗

單因素試驗設計：α-淀粉酶的反應條件為pH 5.5，溫度70 ℃，時間20 min，酶用量4 u/g，在其他條件不變的情況下，以抗性淀粉得率為考察指標，分別改變反應pH、溫度、時間和用量。

1.3.3 抗性淀粉的測定

參照Goni[7]法。取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，用緩沖溶液調節(jié)pH為5.8后，加入過量α-淀粉酶沸水浴30 min；冷卻至室溫后，離心棄去上清液，再加入蒸餾水洗滌殘留物，離心去上清液；加入6 mL濃度為2 mol/L的氫氧化鉀溶液，振蕩30 min至沉淀完全溶解后，調節(jié)pH為4.4，加入過量糖化酶，60 ℃水浴45 min；溶液冷卻后離心并反復洗滌沉淀收集上清液，定容至100 mL，采用DNS法測溶液中還原糖的含量。

抗性淀粉含量=葡萄糖含量×0.9

抗性淀粉得率/%=抗性淀粉含量/總淀粉含量×100

1.3.4 抗酶解性測定[8]

分別稱取3種淀粉樣品5 g,配成10%的淀粉溶液，加入足量的耐高溫α-淀粉酶，置于85 ℃的恒溫水浴振蕩器中，分別在反應時間為2、6、12、24 h時測定溶液中的還原糖含量。

1.3.5 抗性淀粉的結構研究方法1.3.5.1 差示掃描量熱法[9]

稱取少量抗性淀粉樣品置于氧化鋁坩堝中，密封后以空白皿為參比，然后以10 ℃/min的速率升溫，掃描的溫度范圍為30～250 ℃。

1.3.5.2 掃描電子顯微鏡法[10]

將待測淀粉樣品置于105 ℃的烘箱中干燥6 h，在紅外燈下用雙面膠將樣品固定在樣品臺上，然后將進行噴金處理后的樣品保存于干燥器中。觀察并拍攝淀粉顆粒形貌。

1.3.5.3 X-射線衍射法[11]

測試前將樣品在相對濕度為100%的干燥器中放置24 h以上，然后將淀粉樣品放入X-射線衍射儀進行掃描測定，其操作條件為：起始角：4°；終止角：60°；步長：0.08；掃描速度：5 °/min；積分時間：2 s。

1.4 數據處理

試驗數據分析和作圖軟件使用SPSS Statistics軟件和Origin 7.5。數據分析采用平均值±標準偏差。所有試驗均重復4次。

2 結果與分析

2.1 溫度對抗性淀粉得率的影響

控制溫度變量分別為50、60、70、80、90、100 ℃，其他條件保持不變，測定并計算抗性淀粉得率，結果見圖1。

圖1 溫度對抗性淀粉得率的影響

由圖1可知，RS的得率隨溫度的升高而升高，80 ℃時的得率最高；繼續(xù)升溫后抗性淀粉得率迅速下降。說明適當的升溫有利于α-淀粉酶對淀粉進行降解，提高抗性淀粉的得率，但是溫度過高導致淀粉過度降解，產生短直鏈淀粉，不利于抗性淀粉的形成。故最適反應溫度為80 ℃。

2.2 pH對抗性淀粉得率的影響

調節(jié)溶液pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他條件保持不變，制備抗性淀粉，其得率如圖2所示。

圖2 pH對抗性淀粉得率的影響

由圖2可以看出，在適宜條件(70 ℃, 4 u/g，40 min)下，抗性淀粉的得率隨pH改變呈現先增后減的趨勢,且當pH為5.5時，得率最高，這是因為在pH 5.5時，酶的活性最適，對淀粉的酶解作用最佳，酶解過度或不足都會使抗性淀粉的得率降低。故選擇5.5為最佳反應pH。

2.3 時間對抗性淀粉得率的影響

控制反應時間分別為10、20、30、40、50、60 min，其他條件保持不變，制備抗性淀粉，其得率如圖3所示。

圖3 時間對抗性淀粉得率的影響

由圖3可以看出在反應溫度為70 ℃，酶用量4 u/g，pH 5.5的條件下，抗性淀粉得率隨時間延長逐漸上升，在40 min時達到最高，之后隨時間延長而下降。一定的酶解時間有利于淀粉分子酶解，并重新排布形成新的更穩(wěn)定晶型；酶解過度會使淀粉分子中α-1,4糖苷鍵大量破壞，產生過多短鏈淀粉分子，不利于抗性淀粉的形成。

2.4 酶用量對抗性淀粉得率的影響

控制酶用量分別為0、2、4、6、8、10 u/g，其他條件保持不變，制備抗性淀粉，其得率如圖4所示。

圖4 酶用量對抗性淀粉得率的影響

抗性淀粉的得率隨著酶用量的增加而提高,大于4 u/g時呈遞減趨勢。加入酶量少時，淀粉被切斷程度不夠，淀粉糊的黏度仍然很大[12]，不易于直鏈淀粉分子相互接近形成結晶；加入酶量太大，黏度過低，也不利于抗性淀粉的形成。因此,酶添加量為4 u/g為最佳。

綜上可以得出雙酶法制備抗性淀粉的α-淀粉酶的最佳反應條件為：pH 5.5、溫度80 ℃、反應時間40 min、酶用量4 u/g，在此條件下抗性淀粉的得率為45.2%。單酶法和濕熱法制備抗性淀粉的得率分別為32.6%和15.4%。

2.5 抗酶解性測定

表1反映了3種抗性淀粉的抗酶解性。隨著酶解時間的延長，3種抗性淀粉的酶解率均有增加，但是雙酶法制得的抗性淀粉其酶解速率明顯小于單酶法和濕熱法制得的抗性淀粉。這是因為α-淀粉酶與普魯蘭酶雙酶處理，淀粉分子被水解成短直鏈分子鏈，短直鏈分子之間通過氫鍵連接成緊密的雙螺旋結構，形成新的結晶結構，從而減少淀粉分子與酶的結合位點，不易與酶結合而發(fā)生降解[13]，因此具有較強的抗酶解性能。

表1 淀粉酶解率/%

注：所有結果均通過正負標準偏差計算 (n=4)。與濕熱法RS相比，a 代表P<0.01，b 代表P<0.05。

2.6 掃描電鏡觀察

圖5a～圖5d分別為原大米淀粉、單酶法抗性淀粉、濕熱法抗性淀粉以及雙酶法抗性淀粉的電鏡掃描圖。觀察圖5a可以發(fā)現原大米淀粉顆粒表面是光滑的，呈不規(guī)則圓形或多邊形；經熱處理后如圖5c，觀察到淀粉顆粒呈現不規(guī)則、無統一形態(tài)，表面輪廓粗糙，且結構比較疏松；而經單酶處理后如圖5b，淀粉顆粒呈現粗糙不規(guī)則的表面結構，結合較前2種淀粉相對緊密，但是顆粒表面卻出現了裂痕或凹坑，并且可以觀察到有很多堆疊密度較高的小碎片生成，有類似蜂巢狀的結構出現；雙酶法制備的抗性淀粉其顆粒結構如圖5d所示，相比之下，其顆粒形貌呈現較大且緊湊的結晶，這得益于經過2種酶協同處理后，其短直鏈淀粉在回生條件下進行重組，形成螺旋結構，使得淀粉顆粒結構更加緊密不易被酶解的特性。

圖5 4種淀粉的SEM觀察

2.7 DSC差熱分析

大米淀粉、單酶法抗性淀粉、濕熱法抗性淀粉、雙酶法抗性淀粉的DSC如圖6所示。4種淀粉的相變峰值溫度依次升高，分別為159、177 、180 、208 ℃。與原淀粉相比，抗性淀粉的起始糊化溫度、峰值溫度、終止溫度和糊化焓具有顯著的增加，其中雙酶改抗性淀粉顯示了較寬的糊化峰，糊化溫度最高，這說明雙酶改抗性淀粉中有序結構最多，其分子間作用力維持下的雙螺旋結構最穩(wěn)定，而有序的結構更容易形成穩(wěn)定的結晶結構[14]。因此，雙酶改抗性淀粉具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 4種淀粉的DSC圖

2.8 淀粉的X-衍射分析

原淀粉、濕熱法抗性淀粉、雙酶法抗性淀粉和單酶法抗性淀粉的X-衍射圖譜見圖7。從圖7中可以看出大米原淀粉在衍射角為15、17、18和23 °處有強吸收峰，是典型的A型結晶結構[15]；濕熱法抗性淀粉則沒有很明顯的衍射峰，說明在加熱過程中，損壞了淀粉的結晶結構，呈現無序的結構狀態(tài)；用普魯蘭酶處理后，抗性淀粉樣品的衍射峰顯示了新的結晶結構，其衍射角為12、14和19 °，為V型結構[16]；結合α-淀粉酶處理之后，抗性淀粉的衍射峰較單酶法抗性淀粉又新增加了新的結晶構型，其衍射角為12、14、17、20和23 °，為B和V型混合結晶結構。這一結果表明這種結構對α-淀粉酶有更大的抗消化性。

圖7 4種淀粉的X-射線圖譜

3 結論

采用α-淀粉酶與普魯蘭酶協同作用的方法研究大米抗性淀粉的制備方法和結構表征。其中，通過單因素試驗得出α-淀粉酶的最佳反應條件，使得抗性淀粉得率達到45.2%，而單酶法和濕熱法制備的抗性淀粉得率僅分別為32.6%和15.4%，說明雙酶法能夠提高抗性淀粉的得率和含量。與此同時，抗酶解試驗表明，在相同的水解條件和水解時間(2、6、12和24 h)下，雙酶法抗性淀粉的水解率分別為6.55%、7.12%、7.55%和8.02%，而濕熱法抗性淀粉和單酶法抗性淀粉均明顯高于雙酶法抗性淀粉的水解率，說明雙酶法制得的抗性淀粉不僅得率高，而且具有良好的抗酶解作用。通過DSC、SEM和X-RD分析可以得出雙酶法制得的抗性淀粉較濕熱法和單酶法制得的抗性淀粉有糊化熱性能穩(wěn)定、空間結構緊密以及結晶度高等優(yōu)點。

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