王 霞 丁繼峰 鹿保鑫 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(黑龍江省雙鴨山市友誼縣食品藥品監(jiān)督管理局2，雙鴨山 155800)

蛋白質(zhì)是人體維持正常生命活動最基本的物質(zhì)，人體每天必須從食物中攝取一定量的蛋白質(zhì)，補(bǔ)充必需氨基酸的攝入量，從而維持人體的正常生活和生命需要[1-3]。玉米胚芽含有豐富的脂肪和蛋白資源，其中胚芽蛋白具有良好的功能性質(zhì)，可以作為食品添加劑添加到食物當(dāng)中從而改善食物的感官和組織特性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，提高營養(yǎng)價(jià)值，玉米胚芽中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%左右，主要為白蛋白和球蛋白，且玉米胚芽蛋白中富含多種人體必需氨基酸，其中賴氨酸和色氨酸含量相對較高，特別是賴氨酸高達(dá)5.8%左右[4-5]。本研究首先采用超臨界CO2萃取方法制備脫脂玉米胚芽粉，利用酶法和堿溶酸沉法[6-11]相結(jié)合的提取玉米胚芽粉中的蛋白。探討酶添加量、提取溫度和pH等因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響，對試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化組合，對提取物中氨基酸組成進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

脫脂玉米胚芽粉：自制。α-淀粉酶：北京奧得星生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉：南京化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：南京化學(xué)試劑有限公司；SDS(十二烷基磺酸鈉)：北京康倍斯科技有限公司；Acr(丙烯酰胺)：北京康倍斯科技有限公司；甘氨酸：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；溴酚藍(lán)：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)R250：上?；瘜W(xué)試劑有限公司等；以上均為分析純。

1.2 主要儀器

HA121-50-01超臨界流體萃取裝置：南通市華安超臨界萃取有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-160粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DELTA 320 型酸度計(jì)：梅特勒—托制多儀器(上海)有限公司；SPD50自動定氮儀：北京三品科技儀器有限公司；L-8800全自動氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工藝流程

玉米胚芽→脫除脂肪→玉米胚芽蛋白提取液→調(diào)節(jié)pH 9.0→加溫?cái)嚢琛?次離心→提取上清液→調(diào)pH 6.3加α-淀粉酶→65 ℃酶解→調(diào)pH→2次離心→沉淀脫鹽→蛋白含量測定

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇對玉米胚芽蛋白提取效果有影響的4個主要因素：α-淀粉酶添加量X1，提取溫度X2，酶解時間X3，酸沉pHX4，以蛋白提取率為考核標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定中心組合因素(α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時間、提取pH)與水平。以玉米胚芽蛋白提取率為響應(yīng)值，通過二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。變量參數(shù)P=4；星號臂值R=2；±1水平的因素點(diǎn)試驗(yàn)全部實(shí)施為Mc=2P=16；±R水平的星號臂點(diǎn)為MR=2P=8；為了使得二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)具有正交性，各因素是零水平的中心為M0=12；總試驗(yàn)點(diǎn)N=MC+MR+M0=36。

1.3.4 玉米胚芽蛋白提取率的測定

玉米胚芽提取率=

1.3.5 玉米胚芽蛋白的電泳檢測

采用垂直板電泳，根據(jù)表1濃縮膠分離膠配方依次灌膠，制備樣品，混勻冷卻后上樣，在90 V恒流條件下1 h，后100 V恒流條件下電泳3 h。電泳完畢后染色、脫色直至背景清晰為止。

1.3.6 玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測定

大多數(shù)氨基酸與茚三酮衍生物呈藍(lán)紫色，在570 nm處有最大吸收；脯氨酸與茚三酮衍生物呈黃色，在440 nm處有最大吸收，根據(jù)這一特點(diǎn)，采用氨基酸全自動分析儀，進(jìn)行玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米胚芽蛋白提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 α-淀粉酶添加量對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖1中的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，酸沉pH為4.0，酶解時間2 h，α-淀粉酶添加量分別在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%進(jìn)行研究，從圖1可以看出，α-淀粉酶的添加量在0.1%～0.3%之間時，隨著α-淀粉酶添加量的增加玉米胚芽蛋白提取率而顯著增加，在添加量為0.3%時，提取率達(dá)到最高值62.81%。繼續(xù)增加α-淀粉酶添加量時，蛋白提取率有所下降。因此選取α-淀粉酶的最適添加量為0.3%。

圖1 α-淀粉酶添加量對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.2 提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖2中的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，α-淀粉酶添加量為0.3%，酸沉pH為4.0，酶解時間2 h，提取溫度分別25～75 ℃進(jìn)行試驗(yàn)以測定玉米胚芽蛋白的提取率，其中提取溫度在25～65 ℃之間時，玉米胚芽蛋白提取率隨著提取溫度的上升而顯著增加，在溫度為65 ℃時，蛋白提取率達(dá)到最大為61.74%。繼續(xù)升高時，蛋白提取率有所下降，可能是因?yàn)檫^高的溫度使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變甚至變性所致。根據(jù)溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響關(guān)系曲線選取最適提取溫度為65 ℃。

圖2 提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.3 酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖3的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，在α-淀粉酶添加量為0.3%，酸沉pH為4.0，酶解時間分別為0.5～2.5 h條件下進(jìn)行試驗(yàn)，隨著酶解時間延長，玉米胚芽蛋白提取率逐漸增加，在2 h以后達(dá)到平衡，繼續(xù)延長酶解時間對蛋白提取率的提高影響不大。根據(jù)酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響關(guān)系曲線選取最適酶解時間2 h。

圖3 酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.4 PH對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖4中試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，在α-淀粉酶添加量為0.3%，酶解時間為2h，酸沉pH為3.0～5.0，進(jìn)行試驗(yàn)，在pH在4.0時，蛋白提取率達(dá)到最大為61.99%。pH在小于或者大于4.0時，蛋白提取率較低，說明玉米胚芽蛋白的等電點(diǎn)在4.0左右，偏離等電點(diǎn)時，一部分蛋白重新被溶解，蛋白含量有所降低。因此選擇pH為4.0做為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)的最優(yōu)水平。

圖4 pH對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2(續(xù))

回歸方程的方差分析及F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4和表5。

表3 F檢驗(yàn)分析表

表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表

表5 t檢驗(yàn)方差分析表

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以玉米胚芽蛋白提取率作為衡量指標(biāo)即Y值，得到以4種影響因素的編碼值為自變量的回歸方程如下：

Y=-390.655 764+124.684 945X1+9.891 081X2+27.151 451X3+46.218 900X4-151.078 556X12+1.270 573X1X2-0.091 431X22-23.998 524X1X3+0.112 030X2X3-9.704 570X32-14.894 267X1X4+0.262 115X2X4+3.640 295X3X4-8.243 142X42

回歸方程顯著性分析結(jié)果：F1=38.57>F0.01=3.03，說明差異極顯著。失擬性檢驗(yàn)F2=2.27

2.2.1.1主效應(yīng)分析

4種因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響程度見表6，由表可以得出4種因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響順序?yàn)椋篨2>X3>X1>X4，即提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率影響最大，酶解時間次之，再次為α-淀粉酶添加量，pH對其影響最小。

表6 關(guān)鍵因子重要性分析

2.2.1.2 模擬尋優(yōu)及驗(yàn)證

對回歸方程進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬尋優(yōu)，結(jié)果見表7，得到玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量0.31%，提取溫度63.29 ℃，酶解時間2.12 h，pH 3.99，理論蛋白提取率為63.12%。根據(jù)實(shí)際操作情況，α-淀粉酶添加量0.3%，提取溫度63 ℃，酶解時間2 h，pH4.0，為條件進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際蛋白提取率為61.86%，誤差為2%≤5%，說明優(yōu)化模型擬合較好。

表7 試驗(yàn)結(jié)果

注：3次測定值分別為61.79%、61.86%、61.92%的平均值。

2.2.2 玉米胚芽蛋白電泳檢測結(jié)果

對所提取的玉米胚芽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖5所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，接合各蛋白遷移率Rf值，可算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku，說明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。

圖5 蛋白電泳圖

2.2.3 玉米胚芽蛋白的氨基酸組成測定結(jié)果

在酸性條件下，經(jīng)氨基酸全自動分析儀檢測，玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸，見圖6和表8。

圖6 氨基酸色譜分離圖

表8 人體所需8種氨基酸與玉胚芽蛋白所含氨基酸對照表

注：+表示含有該種氨基酸，—表示不含該種氨基酸。

3 結(jié)論

玉米胚芽經(jīng)過超臨界CO2萃取脫脂后進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn)，在提取過程中添加α-淀粉酶，通過單因素試驗(yàn)考察了α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時間以及酸沉pH 4個因素對提取玉米胚芽蛋白提取率的影響，并在此單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四元二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量0.3%，提取溫度63 ℃，酶解時間2 h，pH4.0，所制得玉米胚芽蛋白產(chǎn)品提取率為61.86%。經(jīng)過電泳檢測可計(jì)算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku，說明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。在酸性條件下，經(jīng)氨基酸全自動分析儀測定，玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸：蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。

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