， ，，曉環(huán)， ，燕平，，，，，，，

(1.中國科學院 大豆分子設(shè)計育種重點實驗室，中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,黑龍江 哈爾濱 150081；2.中國科學院大學，北京 100049；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院 牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041)

0 引 言

植物器官脫落是自然界中的普遍現(xiàn)象，是植物自我保護的方式之一，但是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物器官的脫落會帶來嚴重的損失，如大豆的落花落莢。對植物器官脫落，特別是作物器官脫落進行研究，具有重要的意義。近年來，關(guān)于植物器官脫落的研究已深入到分子生物學水平，研究認為植物器官脫落的生理生化活動主要發(fā)生在器官基部的離區(qū)內(nèi)。在植物離區(qū)發(fā)育和器官脫落相關(guān)基因的研究中，擬南芥和水稻的研究較為成熟。在擬南芥中，已鑒定出多個與離區(qū)發(fā)育和器官脫落相關(guān)基因，如影響花器官的離層發(fā)育的KNAT/BP基因[1]和引發(fā)花器官脫落的IDA和HAESE基因[2]。并且解析了由AS1、AS2、JAG、KNAT1/BP和FIL等組成的擬南芥果莢離層發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3-5]。在水稻中，落粒性的分子機制研究也有了突破性進展，目前已成功克隆了落粒性基因SH4、SHA1、qSH1和OsSH1[6-9]。

大豆花莢脫落普遍存在于大豆生殖生長過程中，是影響產(chǎn)量提高的重要因素之一。實驗和實踐證明，通過降低花莢脫落率，提高大豆籽粒生產(chǎn)的潛力很大[10]。大豆花莢脫落率可達30%～80%[11]，在不同品種間存在明顯差異，這為研究調(diào)控大豆花莢離區(qū)發(fā)育和器官脫落相關(guān)基因提供了材料平臺。長期以來，研究者對大豆花莢脫落的生理生化和激素水平進行了大量研究，在大豆花數(shù)和莢數(shù)相關(guān)QTL定位方面也取得了較大的進展[12-13]，但在花莢脫落基因定位方面的研究相對較少。

關(guān)聯(lián)作圖是以自然群體為材料，以連鎖不平衡為基礎(chǔ)的一種分析方法，可用于鑒定群體內(nèi)與目標性狀密切相關(guān)的候選基因或遺傳標記。關(guān)聯(lián)作圖自Thornsberry等首次應(yīng)用于植物數(shù)量性狀研究后[14]，因其作圖不需構(gòu)建群體、定位精確、考察位點多[15]等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于作物數(shù)量性狀基因定位研究。近些年利用關(guān)聯(lián)作圖解析與大豆產(chǎn)量性狀相關(guān)SSR分子標記的研究已成為熱點，2008年文自翔等[16]對大豆的16個農(nóng)藝、品質(zhì)性狀與SSR標記進行了關(guān)聯(lián)分析；2013年范虎等[17]對百粒重、開花期、成熟期等農(nóng)藝性狀與SSR標記進行關(guān)聯(lián)分析。在范虎的研究中共獲得51個關(guān)聯(lián)位點，其中16個與連鎖分析定位的QTL一致。

研究以東北春大豆種質(zhì)資源組成的自然群體為實驗材料，種植于黑龍江省農(nóng)科院牡丹江分院大豆試驗田，對其花莢脫落情況精確鑒定，2 a重復。利用分布于20個連鎖群上的205個SSR標記進行基因分型。在遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡情況的分析基礎(chǔ)上，利用關(guān)聯(lián)分析方法解析與東北春大豆花莢脫落率顯著相關(guān)的分子標記位點。研究結(jié)果可為后續(xù)相關(guān)基因克隆和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及田間設(shè)計

以1960年-2011年東北育種單位育成的主要品種和部分祖先品種為材料，2011年為104個東北春大豆品種，2012年在2011年已有品種的基礎(chǔ)上增加至314個。田間試驗分別于2011年和2012年在黑龍江省農(nóng)科院牡丹江分院大豆試驗田進行，隨機區(qū)組實驗設(shè)計。2011年每個品種種植4行，行長3 m，行距70 cm，種植密度為每平方米10株，3次重復。2012年行長2 m，行距65 cm，種植密度分別為每平方米10株和20株。2 a使用同樣的田間管理方法。

1.2 表型性狀調(diào)查與分析

Fehr[18]提出的大豆生育時期的鑒定方法確定大豆生育時期。在R1期，每品種連續(xù)取5株，在壟上用紗布網(wǎng)將5株圍起，壟上地面紗布網(wǎng)封閉，形成上開口的長方形箱，保證花莢脫落在封閉的長方形箱內(nèi)。在花期和成熟期分別調(diào)查紗布網(wǎng)內(nèi)花和莢的脫落數(shù)，R8期對紗網(wǎng)內(nèi)5株進行考種，花莢脫落率為平均單株花莢脫落數(shù)占平均單株花莢總數(shù)的百分比。利用SAS 8.0軟件分別統(tǒng)計花莢脫落率的平均值、標準差、變異系數(shù)等。

1.3 SSR標記全基因組掃描

利用改良的SDS法[19]，從大豆種子中提取總DNA。依據(jù)2011年統(tǒng)計的花莢脫落率結(jié)果，由高到低選擇10份有代表性的品種作為樣本篩選引物，從大豆公共遺傳圖譜的1000對引物中篩選出均勻分布于在20個連鎖群具有多態(tài)性的引物205對。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含1 μL DNA(100 ng·L-1)、1 μL 引物對(10 ng·L-1)、5 μL 2×Takara PCR master mix，3 μL dH2O，使用ABI Gene Amp PCR System 9700 PCR 儀擴增。PCR反應(yīng)程序為95℃ 4 min；95℃ 30 sec，46℃ 30 sec，72℃ 30 sec，40個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。用12%的聚丙烯氨酰胺凝膠分離PCR擴增產(chǎn)物，EB替代染料染色。膠片在BIO-RAD Gel Doc XR System成像系統(tǒng)中掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1SSR標記分析。用Quantity One軟件依據(jù)Takara 50 bp DNA Ladder Marker確定SSR等位變異的分子量，根據(jù)聚丙烯凝膠電泳的結(jié)果統(tǒng)計每個樣品的等位變異類型。

用Power Marker V3.25 軟件計算每個SSR位點的變異數(shù)目、變異頻率和多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。用STRUCTURE 2.3軟件對2011年(104個品種)和2012年(314個品種)的群體進行類群劃分。本文選取205個SSR位點進行分析，假設(shè)每個位點獨立，并設(shè)定群體數(shù)目(K)為2～10每個K值運行5次，再跟據(jù)Evanno[20]等發(fā)表的方法確定合適的K值。公式為：Δk=m[|L(K+1)-2L(K)+L(K-1)|]/s[L(K)]。

用TASSEL 2.1軟件中Link.Diseq.分析樣本中成對SSR位點的r2和D′值，繪制LD配對情況矩陣圖。從中篩選出共線(位于同一連鎖群)SSR位點對，以D′值作為縱坐標，以SSR位點對的相對遺傳距離為橫坐標，利用SPSS 19繪制衰減散點圖、并配置對數(shù)函數(shù)方程。

1.4.2表型性狀與SSR標記的關(guān)聯(lián)分析。用TASSEL 2.1軟件中的GLM(general linear model)程序，將各個體的Q值作為協(xié)變量，對東北春大豆的表型數(shù)據(jù)和SSR標記的變異進行回歸分析，分析結(jié)果中p<0.05的標記被認為與目標性狀相關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

對2011年和2012年的田間表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知，見表1。

表1 供試群體材料花莢脫落率的統(tǒng)計分析Tab.1 Statistic data of flower and pod abscission rate

2011年大豆花莢脫落率為22.63%～77.90%，平均花莢脫落率為49.26%。2012年，種植密度為每平方米10株的大豆花莢脫落率為10.86%～59.16%，平均花莢脫落率為32.84%；種植密度為每平方米20株的大豆花莢脫落率為15.93%～53.34%，平均花莢脫落率為33.36%。比較兩年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，2011年的大豆花莢脫落率的平均值高于2012年兩種種植密度，且差異較大。比較2012年不同種植密度的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，種植密度為每平方米10株的大豆花莢脫落率低于種植密度為每平方米20株，差異也較大。2 a測得的相同品種大豆花莢脫落率雖然不同，但在不同年際、不同種植密度的群體中各品種的花莢脫落率高低趨勢是一致的。

2.2 遺傳多樣性分析

利用205對SSR引物標記分析2011年和2012年的參試東北春大豆的遺傳多樣性，統(tǒng)計各位點等位變異數(shù)和多樣性信息量(polymorphism information contents,PIC),見表2。2 a中所有標記位點的等位變異數(shù)與其PIC值都呈極顯著正相關(guān)(2011年：r=0.551，p<0.01；2012年：r=0.528，p<0.01)。

在2011年104份大豆材料的205個SSR標記中共檢測到等位變異659個，標記的等位變異數(shù)目變化范圍為2～10個，每個標記平均有3.214個等位變異，標記PIC值變幅為0.054～0.766。其中，N連鎖群的平均PIC值最高，為0.456；H連鎖群的平均PIC值最低，為0.27。

在2012年314份供試材料的205個SSR標記中共檢測到等位變異763個，標記的等位變異數(shù)目變化范圍為2～12個，每個標記平均有3.722個等位變異，標記PIC值變幅為0.054～0.771。其中，D1b連鎖群的平均PIC值最高，為0.453；H連鎖群的平均PIC值最低，為0.280。

在所有SSR標記中，Sat_406(A2)和Satt592(O)均檢測到5個等位變異，PIC值分別為0.703和0.357，差異很大。Satt592等位變異的分布不均勻，其中Satt592-1的頻率高達76%，說明Satt592的選擇傾向性較強，說明Satt592可能與控制某農(nóng)藝性狀的基因緊密連鎖。

表2 2011年和2012年東北春大豆品種中205個SSR位點的等位變異和多態(tài)性信息含量(PIC)Tab.2 Allele number and polymorphic information content (PIC) of 205 SSR markers in 2011 and 2012 northeast spring sowing soybeans

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)是關(guān)聯(lián)分析在植物遺傳學中應(yīng)用的首要限制因素，在進行關(guān)聯(lián)分析之前，明確群體的遺傳結(jié)構(gòu)并在分析中加以控制，能夠降低偽關(guān)聯(lián)的概率。研究利用205對引物數(shù)據(jù)，采用基于數(shù)學模型的聚類方法對參試材料進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，確定參試材料的亞群數(shù)目和群體結(jié)構(gòu)。根據(jù)Evanno的方法，用ΔK確定K值。結(jié)果表明當參試種質(zhì)的等位變異頻率特征類型數(shù)K=2時，2011年104份和2012年314份材料的ΔK都為最大值。因此判斷兩樣本亞群數(shù)都為2，群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖1所示。按上述方法分類方法，將組成各亞群中品種的花莢脫落率進行統(tǒng)計，見表3。結(jié)果表明2011年不同品種間花莢脫落率差異為3.5倍，2012年種植密度為10株每平方米的不同品種間脫落率差異可達5.4倍，2012年種植密度為20株每平方米的不同品種間脫落率差異為3.3倍。分別對不同年際、不同種植密度兩亞群進行單因素方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)顯示，兩亞群間花莢脫落率差異顯著，說明K=2與大豆花莢脫落率高低亞群的劃分一致。

圖1 2011年及2012年參試東北春大豆群體結(jié)構(gòu)Fig.1 Population structure in Northeast spring sowing soybeans of 2011 and 2012注：2011年和2012年參試東北春大豆群體結(jié)構(gòu)都為2個亞群，X軸為品種數(shù)目，Y軸上標記的數(shù)值代表該樣品為該亞群的可能性。兩種不同顏色代表STRCTURE軟件預測被分為2個亞群。

2011年(10 plants·m-2)2012年(10 plants·m-2)2012年(20 plants·m-2)亞群SubpopulationPOP1POP2POP1POP2POP1POP2數(shù)量Number3470197116197116平均值Mean(%)51.3345.2529.2039.2631.6336.29標準差SD(%)11.3811.848.2910.066.957.67范圍Range(%)32.66～77.9022.62～72.0910.86～51.9916.49～59.1615.93～52.9217.27～53.34F值 F value2.5991.6630.30p值 p value0.010.000.00

注：兩個亞群的單因素方差分析：p<0.05表示兩亞群間差異顯著，p<0.01表示兩亞群間差異極顯著。

2.4 東北春大豆的連鎖不平衡

圖2顯示了各個連鎖群上SSR位點間連鎖不平衡的情況，在205個SSR位點所有組合中，共線性的組合(同一連鎖群)和非共線性組合(不同連鎖群)都存在一定程度LD。LD成對位點數(shù)在2011年群體基因組中占所有位點組合的5.40%，在2012年群體基因組中占17.08%。從絕對數(shù)量上看，2012年群體擁有的不平衡成對位點數(shù)較2011年群體位點多，但從D′值次數(shù)分布及平均值來看，2011年群體間連鎖不平衡程度更高，見表4。

LD衰減延伸的距離決定了關(guān)聯(lián)分析所需使用分子標記數(shù)量以及關(guān)聯(lián)分析精度。將共線性成對SSR位點的D′值隨遺傳距離的增加而發(fā)生的變化做回歸分析，無論是在2011年還是2012年群體中，SSR位點D′值得衰減都很快，見圖3，且兩年D′值衰減都遵循方程Y=bln(x)+c。以D′最大值與最小值中點0.415(2011年)和0.492(2012年)為衰減臨界，可分別求出2011年群體和2012年群體LD衰減延伸的最小距離分別為23.37cM和2.62cM。兩年LD衰減延伸的最小距離不同且差別較大，可能是由于2012年的實驗材料多，品種間親緣關(guān)系復雜所致。

圖2 2011和2012年東北春大豆20個連鎖群205個SSR位點間連鎖不平衡的分布Fig.2 Distribution of LD among 205 SSR loci on 20 linkage groups in northeast spring sowing soybeans of 2011 and 2012注：黑色對角線上方每一像素格使用右側(cè)的色差代碼表征成對位點間D′值大小，對角線下方為成對位點間LD的支持概率。

群體PopulationLD成對位點數(shù)Number of LD locus pairsD'值次數(shù)分布 Freq.dis.of D'(p<0.01)0-0.20.2-0.40.4-0.60.6-0.80.8-1D'平均值Mean of D'104份1123(5.40%)27593340113500.43314份3554(17.08%)1143193237186220.27

圖3 共線SSR位點D′在2011年群體(A)及2012年群體(B)基因組隨遺傳距離衰減散點圖Fig.3 Attenuation of D′value between synthetic marker pairs along with genetic distance increase in 2011 (A) and 2012 (B)

2.5 SSR標記與東北春大豆花莢脫落性狀的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有33個位點與大豆花莢脫落性狀顯著相關(guān)，其中Satt534(B2)、Satt452(E)、Satt244(J)和Satt478(O)在兩年中都被檢測到，見表5。

比較2011年與2012年重復的104個品種的花莢脫落率關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①與2011年花莢脫落性狀顯著相關(guān)的SSR位點有7個，其中解釋率最高的為Satt534(B1)，其對表型變異的解釋率為0.21。與2012年花莢脫落率顯著相關(guān)的SSR位點有12個，其中解釋率最高的為Sat_245(L)，其對表型變異的解釋率為0.20。② 兩年均與花莢脫落率顯著相關(guān)的位點有3個，分別為Satt534(B2)、Satt244(J)以及Satt478(O)，平均解釋率分別為0.19、0.15和0.14。

表5 與東北春大豆落花落莢率顯著相關(guān)的標記位點及其對表型變異的解釋率Tab.5 Marker loci associated with flower and pod abscission rate of northeast spring sowing soybeans and their explained phenotypic variation

比較2012年不同密度下種植的314個品種的花莢脫落率關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①與每平方米10株的材料大豆花莢脫落率性狀顯著相關(guān)的位點有18個，其中解釋率最高的為Satt452(E)，其對表型變異的解釋率為0.08。與每平方米20株的材料大豆花莢脫落率性狀顯著相關(guān)的位點有15個，其中解釋率最高的為Satt381(K)，其對表型變異的解釋率為0.09。②兩種種植密度條件下均與花莢脫落率顯著相關(guān)的位點有8個，其中Satt381(K)的解釋率最高為0.08。

比較2011年104個品種和2012年種植密度為每平方米10株314個品種的花莢脫落率關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Satt534(B2)和Satt452(E)均與花莢脫落率顯著相關(guān)。

3 討 論

3.1 關(guān)聯(lián)分析與連鎖不平衡

關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡(LD)為基礎(chǔ)的一種分析方法，可以用于分析表型性狀與標記或候選基因遺傳變異之間聯(lián)系[21]。LD分析的是一個群體內(nèi)的不同座位等位基因之間的非隨機關(guān)聯(lián)，可以是兩個標記間或兩個基因/QTL間的隨機關(guān)聯(lián)，也可以是一個基因/QTL與一個標記座位間的隨機關(guān)聯(lián)，所以又稱配子不平衡、配子相不平衡或等位基因關(guān)聯(lián)[22]。在影響群體LD水平的眾多因素中，其中對LD程度具有決定性的影響是物種的交配方式，通常自交物種具有較高水平的LD，異交物種具有較低水平的LD。

大豆是自花授粉植物，其LD水平較高。有研究表明大豆的LD衰減距離大于50 kb[23]，甚至超過10 cM[24]。研究中東北春大豆的LD衰減距離為23.37 cM(2011年)和2.62 cM(2012年)，與前人研究相符。同時也說明LD具有明顯的群體依賴性，研究中兩群體品種雖然都為東北春大豆，但由于群體的組成不同，最終導致兩群體LD衰減距離不同。

3.2 關(guān)聯(lián)分析與功能標記的開發(fā)及應(yīng)用

近年來，隨著關(guān)聯(lián)分析在植物研究中的成功應(yīng)用，許多與大豆產(chǎn)量性狀相關(guān)的功能標記被成功開發(fā)并應(yīng)用。郝德榮等[25]利用1536個SNP標記和209個單倍型分析191個大豆地方品種，得到與產(chǎn)量和產(chǎn)量組成性狀顯著相關(guān)的標記。張丹等[26]應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析鑒定大豆開花基因，將該基因定位在6號染色體上BARC-014947-01929和Satt365兩個標記之間大約300 kb范圍內(nèi)，并找到3個候選基因。研究共檢測到33個與東北春大豆花莢脫落性狀顯著相關(guān)(p<0.05)的SSR標記。其中，Satt534(B2)、Satt452(E)、Satt244(J)和Satt478(O)在兩年中都被檢測到是較為可信的標記位點。已有文獻報道稱Satt534與抗大豆花葉病毒RSC4有關(guān)[27]，Satt452與成熟期基因E4/e4緊密連鎖[28]，Satt244與抗大豆灰斑病Rcs3有關(guān)[29]，Satt478與大豆葉子導水率有關(guān)[30]。其中Satt452與soybase網(wǎng)站上發(fā)布的大豆裂莢基因的QTL有關(guān)，也可能是影響大豆花莢脫落重要的QTL。可以對這些標記進行發(fā)掘，找到具有等位變異的東北春大豆品種，應(yīng)用于大豆育種工作中。

4 結(jié) 論

研究共發(fā)現(xiàn)33個與大豆落花莢脫落相關(guān)的QTL，不同年際和不同種植密度間與花莢脫落性狀關(guān)聯(lián)的QTL不同。其中有4個QTL(Satt534、Satt452、Satt244和Satt478)在兩年中都與大豆花莢脫落率相關(guān)，是較為可靠的QTL。并且已有報道稱Satt452與大豆裂莢性狀相關(guān)，也可能是影響大豆花莢脫落重要的QTL，可以一步分析利用。

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