黃欽耿

(1. 福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心，福建 福州 350008；2. 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350107)

L-亮氨酸為哺乳動(dòng)物8種必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)，市場(chǎng)需求量逐年增多[1]。迄今為止，L-亮氨酸工程菌株主要有大腸桿菌和棒狀桿菌。其中以谷氨酸棒桿菌和黃色短桿菌為出發(fā)菌株的研究最多[2]。谷氨酸棒桿菌是一類重要的工業(yè)氨基酸生產(chǎn)菌株，已成為一個(gè)工業(yè)生物技術(shù)及轉(zhuǎn)化的平臺(tái)菌株，每年生產(chǎn)數(shù)百萬(wàn)噸的氨基酸[3]，其中包括作為風(fēng)味增強(qiáng)劑的L-谷氨酸(350萬(wàn)噸/年)和作為飼料和食品添加劑的L-賴氨酸(250萬(wàn)噸/年)等[3]。谷氨酸棒桿菌在氨基酸的發(fā)酵方面，除了L-谷氨酸和L-賴氨酸這類大宗氨基酸之外，還包括許多的小品種氨基酸，如三類支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAAs)：L-纈氨酸、L-異亮氨酸及L-亮氨酸[4-6]，其每年需求量約在1000～3000噸，其中L-亮氨酸的需求量約在500～800噸/年，特別在飼料行業(yè)中，L-亮氨酸作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)有著特殊的作用，因此受到研究者的廣泛關(guān)注。隨著其應(yīng)用的不斷拓展，市場(chǎng)也在持續(xù)攀升[2]。

目前，發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的，日本企業(yè)占主導(dǎo)地位，尤以日本味之素公司，其在亮氨酸產(chǎn)量和品質(zhì)均具有明顯優(yōu)勢(shì)，大罐產(chǎn)酸能力達(dá)30～35 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為22%～28%，可達(dá)70%以上的提取率，合計(jì)年產(chǎn)量400～500噸。迄今為止，工業(yè)化L-亮氨酸生產(chǎn)菌主要通過(guò)傳統(tǒng)誘變篩選獲得的，這種經(jīng)典育種方法雖可獲得L-亮氨酸相對(duì)高產(chǎn)的優(yōu)良菌株，但該法也會(huì)引入有害突變，使目標(biāo)菌株生長(zhǎng)緩慢，雜酸增多。另外，這種方式工作量大，周期長(zhǎng)，很難在短期內(nèi)進(jìn)一步提高目標(biāo)物產(chǎn)量。為了克服這些問(wèn)題，理性化代謝工程育種正成為氨基酸高產(chǎn)菌株獲得的主要方式。

代謝工程是在對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，從合成生物學(xué)的視角出發(fā)，采用基因工程技術(shù)修飾代謝途徑，定向改造細(xì)胞合成系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)，以提高產(chǎn)物得率或改進(jìn)細(xì)胞性能的目的[2]。本研究以先期通過(guò)傳統(tǒng)復(fù)合誘變手段、結(jié)合結(jié)構(gòu)類似物的篩選方法獲得的一株具有L-甲硫氨酸及L-賴氨酸原養(yǎng)型，高濃度α-噻唑丙氨酸及α-氨基亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的產(chǎn)L-亮氨酸菌株——谷氨酸棒桿菌MD106(CorynebacteriumglutamicumMD106)為出發(fā)菌株，利用谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組序列為模板，采用自殺載體pk18mobsacB介導(dǎo)的基因重組手段，失活panBC基因以及alaT基因，減少L-亮氨酸合成前體物丙酮酸和α-酮基異戊酸消耗，增強(qiáng)L-亮氨酸代謝流，實(shí)現(xiàn)對(duì)L-亮氨酸合成途徑的優(yōu)化，為進(jìn)一步代謝工程優(yōu)化改造L-亮氨酸菌株獲得高產(chǎn)L-亮氨酸的工程菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 谷氨酸棒桿菌MD106(CorynebacteriumglutamicumMD106)為本室選育并保存；載體克隆受體菌EscherichiacoliJM109購(gòu)自TAKARA；自殺載體pk18mobsacB質(zhì)粒為中國(guó)科學(xué)院微生物研究所李寅研究員贈(zèng)送。

1.1.2 主要工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4連接酶等均購(gòu)自TAKARA；基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒等均購(gòu)自上海生工。其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 根據(jù)Genbank的谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組序列，分別設(shè)計(jì)panBC基因以及alaT基因的融合重疊延伸PCR引物。其中，劃線部分序列重疊延伸互補(bǔ)序列，方框中的序列分別為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。

panBC基因的融合延伸引物設(shè)計(jì)如下：

panBC-2：5′- AACTACAGACCTAGAACCTAAGCATCAACAATGCGTCGAATC-3′

panBC-3：5′- TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTGCTTATCGACGCCCTCCTCC-3′

alaT基因的融合延伸引物設(shè)計(jì)如下：

alaT-2：5′-AACTACAGACCTAGAACCTATTGAGGAGTGCTTGGGTGGTCATG-3′

alaT-3：5′-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGG-3′

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：配方參閱參考文獻(xiàn)[7]；LB+10%蔗糖培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10%的蔗糖；LBG培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加0.5%的葡萄糖；菌株的種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：企業(yè)內(nèi)部資料(略)。

1.2 方法

1.2.1panBC基因及alaT基因上下游片段的擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取谷氨酸棒桿菌MD106，并以此為模板，采用panBC-1、panBC-2引物對(duì)與alaT-1、alaT-2引物對(duì)擴(kuò)增panBC和alaT基因的上游片段，panBC-3、panBC-4引物對(duì)與alaT-3、alaT-4引物對(duì)擴(kuò)增panBC基因的下游片段。

反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 33 μL，10×Ex buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物1、2(或3、4)各2 μL，MD106基因組1 μL，ExTaq酶2 μL，混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2 ΔpanBC基因與ΔalaT基因的融合擴(kuò)增及亞克隆 采用上述獲得的回收目的片段，分別以panBC和alaT的上下游片段通過(guò)融合PCR擴(kuò)增獲得截短的panBC基因(ΔpanBC)及截短的alaT基因(ΔalaT)。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 30 μL，10×Ex buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物1、4各2 μL，回收的上游片段及下游片段各2 μL，ExTaq酶2 μL，混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，膠回收試劑盒回收目的片段。

回收獲得的目的片段進(jìn)行T-A連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)胞，菌落PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，并送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 自殺敲除組件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的構(gòu)建 將ΔpanBC與ΔalaT的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒與敲除載體pk18mobsacB同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI進(jìn)行雙酶切。

雙酶切體系60 μL：ddH2O 33μL，ΔpanBC、ΔalaT、pk18mobsacB質(zhì)粒15 μL(約1 μg)，10×H buffer 6 μL，EcoRI、SalI 各3 μL，37℃水浴過(guò)夜酶切。

雙酶切產(chǎn)物切膠回收后用于后續(xù)連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系20 μL：ddH2O 3 μL，雙切回收ΔpanBC、ΔalaT片段12 μL，pk18mobsacB 2 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16℃過(guò)夜連接。

連接反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，37℃，120 r/min復(fù)蘇1 h，取300 μL涂布于含卡那霉素終濃度50 μg/mL的LB平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)約20 h。挑單菌落接種至含終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，提質(zhì)粒篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4 谷氨酸棒桿菌MD106的panBC基因的失活 將獲得的pk18ΔpanBC重組載體電擊轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌MD106感受態(tài)細(xì)胞[采用艾本德(Eppendorf)電轉(zhuǎn)儀，電擊條件為：1800 V，電擊時(shí)間約為4～5 ms]。重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入宿主之后，首先進(jìn)行第一次重組，即通過(guò)單交換的方式整體插入線性插入染色體中，此步可通過(guò)含25 μg/mL卡那霉素的LBG平板進(jìn)行篩選，平板上生長(zhǎng)的克隆可視為成功進(jìn)行一次重組的克隆，對(duì)獲得的已經(jīng)進(jìn)行一次重組的單克隆進(jìn)行LB液體搖菌過(guò)夜，并劃線含10%蔗糖的LB平板，再分別點(diǎn)植LBG及LBG+卡那霉素(25 μg/mL)平板，進(jìn)行二次重組篩選，并對(duì)能夠再LBG平板生長(zhǎng)，不能在LBG+卡那霉素(25 μg/mL)平板生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證染色體panBC基因是否被ΔpanBC替換。

1.2.5 谷氨酸棒桿菌MD106(ΔpanBC)的alaT基因的失活 在獲得的panBC失活菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行染色體alaT基因的失活，將pk18ΔalaT重組載體電轉(zhuǎn)導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌MD106(ΔpanBC)，方法同pk18ΔpanBC的電轉(zhuǎn)及篩選操作。篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證染色體alaT基因是否被ΔalaT替換。獲得谷氨酸棒桿菌MD106(ΔpanBC-ΔalaT)。

1.2.6 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將谷氨酸棒桿菌MD106(ΔpanBC/ΔalaT)與對(duì)照菌株谷氨酸棒桿菌MD106，進(jìn)行搖瓶的二級(jí)發(fā)酵：一級(jí)種子30℃，200 r/min培養(yǎng)18 h，15%移種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，30℃，200 r/min發(fā)酵40 h，測(cè)定菌體密度及分析L-亮氨酸及雜酸類型和含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔpanBC基因及ΔalaT基因的融合擴(kuò)增及驗(yàn)證

以谷氨酸棒桿菌MD106基因組為模板，分別進(jìn)行panBC基因及alaT基因上下游序列的擴(kuò)增(圖1-A)，獲得基因片段大小與理論預(yù)測(cè)的基本一致。

以獲得的上下游片段互為模板，通過(guò)重疊延伸PCR的方法獲得中間缺失了427 bp基因序列的panBC基因(ΔpanBC基因)和中間缺失412 bp基因序列的alaT基因(ΔalaT基因)，其大小與理論預(yù)測(cè)基本一致(圖1-B)。測(cè)序結(jié)果顯示：融合的ΔpanBC基因和ΔalaT基因與ATCC13032的相關(guān)序列幾乎完全一致，證明融合片段構(gòu)建成功。

A：M為200bp leader marker，1、2為panBC基因的上下游片段，3、4為alaT基因的上下游片段B：M為DL2000 DNA leader marker，5為ΔpanBC基因融合片段，6為ΔalaT基因融合片段

圖1 ΔpanBC基因及ΔalaT基因的融合擴(kuò)增

2.2 自殺敲除組件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的構(gòu)建

EcoRⅠ與SalⅠ雙切的ΔpanBC與ΔalaT片段與同樣的酶切并回收的載體pk18mobsacB線性片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖2)。結(jié)果顯示，自殺敲除組件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的構(gòu)建成功。

M：λ-EcoT14 DNA leader marker；1：陰性對(duì)照(pk18mobsacB雙切)；2：pk18ΔpanBC載體的雙切；3：pk18ΔalaT載體的雙切

圖2 pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT重組載體的酶切驗(yàn)證

2.3 重組載體轉(zhuǎn)化MD106及變株的篩選、驗(yàn)證

自殺敲除組件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌MD106后，因載體含有KmR基因，在含25 μg/mL的卡那霉素培養(yǎng)基進(jìn)行初次篩選，獲得一次重組的菌株，一次重組的克隆不多，效率不高，總共不到10個(gè)克隆，這與pk18mobsacB載體本身特性有關(guān)。一次重組菌中的染色體中還含有sacB基因，利用蔗糖進(jìn)行反篩選，以蔗糖為基質(zhì)進(jìn)行再次篩選，過(guò)濾掉一次抗性平板篩選過(guò)程中存在的游離載體，選擇性進(jìn)行保留二次重組的菌株。根據(jù)pk18mobsacB重組特性，在進(jìn)行二次重組的過(guò)程中，可能出現(xiàn)回復(fù)變株，其概率在50%左右，所以需要對(duì)二次重組的克隆需要進(jìn)行進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證，以菌落為模板，分別以panBC-1、panBC-4引物對(duì)和alaT-1、alaT-4引物對(duì)為引物，進(jìn)行PCR篩選和驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物較對(duì)照(以原始MD106基因組為模板)明顯要小，而且對(duì)截短的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，確認(rèn)基因panBC及alaT基因分別被ΔpanBC和ΔalaT基因替換。

M：200 bp DNA leader marker，1：ΔpanBC基因替換驗(yàn)證，2：陰性對(duì)照(MD106菌落PCR驗(yàn)證)，3：MD106(ΔpanBC)菌株P(guān)CR驗(yàn)證，4：panBC缺失基礎(chǔ)上的ΔalaT基因替換驗(yàn)證

圖3panBC及alaT基因缺失菌株的菌落PCR驗(yàn)證

2.4 panBC、alaT基因失活對(duì)MD106發(fā)酵產(chǎn)L-亮氨酸的影響

以初步優(yōu)化的培養(yǎng)基，采用搖瓶二級(jí)發(fā)酵的方式，對(duì)panBC、alaT基因失活菌株及原始MD106菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察雙基因缺失對(duì)菌株生長(zhǎng)、L-亮氨酸產(chǎn)率以及雜酸合成的影響。結(jié)果(表1)顯示：(1)panBC、alaT雙基因失活的重組菌株的生物量較對(duì)照菌株差別不大，說(shuō)明在現(xiàn)有培養(yǎng)基的情形下，雙基因的缺失基本不會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成較為明顯的影響。(2)panBC、alaT雙基因的失活有利于增強(qiáng)L-亮氨酸的代謝流，提高L-亮氨酸產(chǎn)酸率。(3)alaT基因的失活，大大減少了MD106菌株的丙氨酸合成能力，其丙氨酸的合成量減少超過(guò)80%。(4)panBC、alaT雙基因失活菌株，其發(fā)酵總雜酸明顯較對(duì)照菌株要低，而且幅度不僅僅只局限于丙氨酸的減少上，說(shuō)明雙基因的缺失對(duì)于L-亮氨酸的生物合成帶來(lái)影響的同時(shí)，也對(duì)其他氨基酸的合成帶來(lái)了調(diào)控，而且這種調(diào)控對(duì)于積累L-亮氨酸合成來(lái)說(shuō)是有益的。

表1 panBC、alaT雙基因缺失菌株與對(duì)照菌株的部分發(fā)酵指數(shù)

3 討論

丙酮酸是合成三支鏈氨基酸的共同前體物，α-酮基異戊酸既是L-纈氨酸的直接前體物，又是合成L-亮氨酸的間接前體物。因此，在進(jìn)行L-亮氨酸代謝工程改造時(shí)，應(yīng)在增加丙酮酸合成代謝流的同時(shí)，使丙酮酸的代謝流盡可能的流向α-酮基異戊酸，另外，在分支途徑中還應(yīng)使α-酮基異戊酸主要流向L-亮氨酸。

丙酮酸的支路代謝主要包含：通過(guò)轉(zhuǎn)氨合成丙氨酸，這一路經(jīng)很容易實(shí)現(xiàn)，而且對(duì)丙酮酸的消耗巨大，催化合成這一過(guò)程主要包括兩個(gè)轉(zhuǎn)氨酶，即AvtA(avtA基因編碼)和AlaT(alaT基因編碼)，其中AlaT對(duì)丙氨酸的合成貢獻(xiàn)更大，有研究[8]表明，失活A(yù)laT之后，細(xì)胞的丙氨酸的合成大大降低，而且由于AvtA的氨基供體為L(zhǎng)-纈氨酸，所以，通過(guò)失活alaT基因，不僅大量減少丙氨酸合成，減少丙酮酸的消耗，且還相對(duì)能促進(jìn)L-纈氨酸的消耗，并提供L-亮氨酸合成的間接前體物α-酮基異戊酸的量，這一點(diǎn)在本研究當(dāng)中也得到驗(yàn)證，失活alaT基因之后丙氨酸的量降低超過(guò)80%，且雜酸比例也大大降低。

D-泛酸的合成以α-酮基異戊酸為直接前體，經(jīng)羥基酮泛酸甲基轉(zhuǎn)移酶(panB基因編碼)和泛酸合成酶(panC基因編碼)等催化，最終合成泛酸。通過(guò)失活泛酸合成的相關(guān)酶系，增加L-亮氨酸合成前體物，增強(qiáng)L-亮氨酸代謝流[9]。

本研究在傳統(tǒng)方法選育獲得一定遺傳標(biāo)記的產(chǎn)L-亮氨酸菌株MD106的基礎(chǔ)上，采用代謝工程手段L-亮氨酸的前體物丙酮酸及α-酮基異戊酸的消耗路徑進(jìn)行了修飾，使得L-亮氨酸的產(chǎn)率明顯提高，而且雜酸比例大大減少，為下一步的菌種構(gòu)建提供了保障，證明代謝工程的技術(shù)路線完全適應(yīng)于L-亮氨酸的菌種改造，為進(jìn)一步構(gòu)建高產(chǎn)L-亮氨酸工程菌打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEE J W, NA D, PARK J M, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals[J]. Nat. Chem. Biol, 2012(8): 536-546.

[2] HAN M W, J B PARK. Recent progress in development of synthetic biology platforms andmetabolic engineering of Corynebacterium glutamicum[J]. Journal of Biotechnology, 2014(180):43-51.

[3] BECKER J, WITTMANN C. Bio-based production of chemicals, materials and fuels-Corynebacterium glutamicum as versatile cell factory[J]. Curr. Opin. Biotechnol, 2012(23):631-640.

[6] SATOSHI H, MASAKO S, KIMIO U, et al. Engineering ofCorynebacteriumglutamicumfor High Yield L-Valine Production under Oxygen Deprivation Conditions[J]. Appl. Environ. Microbiol, 2013, 79(4):1250-1257.

[7] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南：第三版[M]．北京：科學(xué)出版社，2002.

[8] JAN M, LOTHAR E. Metabolic Function of Corynebacterium glutamicum Aminotransferases AlaT and AvtA and Impact on L-Valine Production[J]. Appl. Environ. Microbiol, 2008, 74(24): 7457-7462.

[9] HERMANN S, LOTHAR E. d-Pantothenate Synthesis inCorynebacteriumglutamicumand Use ofpanBCand Genes Encoding L-Valine Synthesis for d-Pantothenate Overproduction[J]. Appl. Environ. Microbiol, 1999, 65(5):1973-1979.