蔣世春，金洪順，樓惠琴，白 驊

(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000)

遠(yuǎn)端霉素是抗病毒和抗原生動(dòng)物活性的新型低聚肽類抗生素，其衍生物可作為細(xì)胞毒試劑，用于抗腫瘤治療［1］。該產(chǎn)品具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但國內(nèi)研究甚少，主要來自進(jìn)口。由于國內(nèi)遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵單位低，工藝不完善，制約產(chǎn)業(yè)化［2］，為了結(jié)束長期依賴進(jìn)口歷史，打造國產(chǎn)品牌，因此，開展遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌選育，提高發(fā)酵生產(chǎn)水平，降低成本，實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，增強(qiáng)國際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，具有十分重要意義。激光誘變是一種新型的誘變育種新技術(shù)，具有能量密度高，靶點(diǎn)小，單色性和方向性好等特點(diǎn)，因此在工業(yè)微生物育種中得到廣泛的應(yīng)用。作者已報(bào)道了天藍(lán)淡紅鏈霉菌激光高產(chǎn)株選育實(shí)驗(yàn)結(jié)果［3，4］。應(yīng)用 5-氟尿嘧啶選育微生物，文獻(xiàn)已有報(bào)道［5］，但二者復(fù)合誘變選育尚未報(bào)道。本文首次報(bào)道了銅蒸汽激光與5-氟尿嘧啶(5-fu)復(fù)合選育遠(yuǎn)端霉素高產(chǎn)株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

遠(yuǎn)端霉素生產(chǎn)菌——司他鏈霉菌(Streptomyces distallicus)

1.2 培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件

1.2.1 斜面與分離培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件 可溶性淀粉 2，酵母粉 0.5，K2HPO40.05，瓊脂粉 2.5，PH自然，28±1℃培養(yǎng)8-10天。

1.2.2 種子培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件 葡萄糖3，玉米漿干粉 2，酵母粉 0.3，GaCO30.3，K2HPO40.1，28±1℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2天。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件 糊精4，玉米粉 2，黃豆餅粉 2，蛋白胨 0.5，CaCO30.4，NaCL 0.3，接種量10%，28±1 ℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)6-7天。

1.3 誘變處理及篩選方法

1.3.1 誘變處理及篩選方法 銅蒸氣激光選用功率約8 W，輻照時(shí)間4 min。

1.3.2 含50 r/mL的5-氟尿嘧啶平血的制備 稱一定量的5-氟尿嘧啶精品，加入已滅菌的分離培養(yǎng)基中，使之最終濃度達(dá)50 r/mL，然后倒皿，凝固，待用。

1.3.3 單孢子懸浮液的制備 將培養(yǎng)成熟的新鮮斜面加入約10 mL生理鹽水(含0.85%NaCL)，刮下孢子，分散過濾，得單孢子懸浮液，待用。

1.3.4 稀釋、分離 將上述各樣品，進(jìn)行適當(dāng)稀釋、分離，以未經(jīng)任何處理的孢子液進(jìn)行自然分離作對(duì)照組。

1.3.5 平皿的培養(yǎng)及單菌落斜面的篩選 將上述平皿置28±1℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，待長成熟后，挑單菌落接斜面，最后進(jìn)搖瓶試驗(yàn)，測(cè)遠(yuǎn)端霉素效價(jià)。

1.4 遠(yuǎn)端霉素效價(jià)(單位)測(cè)定方法

發(fā)酵液用80%乙醇浸泡，離心，取上清液進(jìn)行HPLC色譜法測(cè)定。流動(dòng)相:溶劑A:乙腈，溶劑B:含水的十二烷基硫酸鈉溶液12 g/L加上12 mL 85%的磷酸，流速為0.25 mL/min，檢測(cè)波長為304 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變劑Laser與5-fu對(duì)遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌致死率的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用Laser輻照4分鐘與5-fu、50 r/mL單一誘變遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌的致死率分別為83.2%、90.6%，而兩者復(fù)合誘變，其致死率為 98.9%，見圖1，并在復(fù)合誘變組中獲得一株遠(yuǎn)端霉素高產(chǎn)株，表明復(fù)合選育效果優(yōu)于單一誘變效果。

圖1 致死率曲線Fig.1 Death curve

2.2 誘變劑Laser與5-fu對(duì)遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌的菌落類型的影響

遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌經(jīng)Laser、5-fu及其復(fù)合處理后，增加了平坦型和半光禿型兩種新的菌落類型，經(jīng)生產(chǎn)能力考察，其效價(jià)分別為饅頭型(正常型)菌落效價(jià)的62%與67%，而車輪型菌落效價(jià)約為正常型的75%，其比例關(guān)系見表1，從表1可知，高劑量復(fù)合誘變組中出現(xiàn)雜合菌落總數(shù)比例高于任一單一誘變組，而自然分離組卻沒有出現(xiàn)新的雜合菌落類型。

表1 菌落類型與比例Tab.1 Colong type and percentage

2.3 誘變劑Laser與5-fu對(duì)遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌抗生素產(chǎn)量的影響

遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌經(jīng)Laser與5-fu及其復(fù)合誘變后，其產(chǎn)量正突變頻率分別為32.5%，和50%，而對(duì)照組為20%，見圖2，從圖2可知，復(fù)合誘變組的正突變率為最高，而且獲得一株高產(chǎn)突變株其產(chǎn)量比對(duì)照株穩(wěn)增1.36倍，而單一誘變組正突變率均比對(duì)照組高，且突變株的產(chǎn)量增幅在100-120%范圍內(nèi)，收到了顯著的誘變效果。

2.4 高產(chǎn)突變株的遺傳特性考察及應(yīng)用

高產(chǎn)突變株經(jīng)遺傳穩(wěn)定性考察連續(xù)傳代F1至F4，其發(fā)酵單位保持穩(wěn)定，結(jié)果見圖3。經(jīng)發(fā)酵罐應(yīng)用后，平均發(fā)酵單位比對(duì)照株提高1.38倍，其代謝曲線見圖4，表明該菌株適合于工業(yè)化大生產(chǎn)要求，是一株高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)菌株。

圖2 突變株產(chǎn)量分布(%)Fig.2 Distribution of antibiotic production of variants

圖3 高產(chǎn)株遺傳穩(wěn)定性考察Fig.3 The productivity of each generation of high-producing strain

2.5 高產(chǎn)突變株的產(chǎn)量提高穩(wěn)定性考察

表2 高產(chǎn)株的產(chǎn)量穩(wěn)定性Tab.2 Fermentation potency of High-producing strain

從表2可知，高產(chǎn)菌株經(jīng)過連續(xù)四批的產(chǎn)量穩(wěn)定性考察，其高產(chǎn)性能經(jīng)久不衰，比出發(fā)菌株的發(fā)酵效價(jià)穩(wěn)增138%，相當(dāng)于產(chǎn)量翻了1.38倍，大大提高了生產(chǎn)水平，降低了生產(chǎn)成本，給企業(yè)帶來了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

圖4 發(fā)酵代謝曲線Fig.4 Metabolic activity of fermentation

目前抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌種的選育主要方法有傳統(tǒng)的理化誘變和基因工程技術(shù)，后者選育必須要透徹研究其生物合成途徑，難度大，時(shí)間長，操作繁瑣，成功率低，風(fēng)險(xiǎn)較大，應(yīng)用性受到局限，但它可作為新抗生素來源的手段之一。而采用前者的傳統(tǒng)理化誘變方法，往往以采用單一因素誘變處理為主，即使采用復(fù)合誘變，其產(chǎn)量提高幅度不寬，效果不顯著，本課題首次研究了銅蒸汽激光與5氟嘧啶復(fù)合處理遠(yuǎn)端霉素產(chǎn)生菌，收到顯著的選育效果，并且該方法可以快速有效地獲得較理想的抗生素高產(chǎn)株，具有較高的實(shí)用價(jià)值，為今后篩選其它抗生素高產(chǎn)菌株提供借鑒，拓寬了它在制藥生物工程中的應(yīng)用前景。

［1］ C.弗奧斯特 F.福里蘭德 M..C.R.戈羅尼.包括遠(yuǎn)端霉素衍生物的抗腫瘤療法.意大利:CN1468099A，2014.

［2］OGAWA H，YAMASHITA Y，KATAHIRA R，et al.UCH9，a new antitumor antibiotic produced by Streptomyces:I producing organism，fermentation，isolation and biological activities［J］.J Antibiotics，1998，51(3):261-266.

［3］吳振倡，王鳳仙，蔣世春，等.天蘭淡紅鏈霉菌(S.coeruleorubidus)激光高產(chǎn)株的選育［J］.激光生物學(xué)報(bào)，1996，5(1):797-799.WU Zhenchang，WANG Fengxian，JIANG Shichun，et al.Selection of laser-high-producing strain in Streptomyces coeruleorubidus［J］.Laser Biology，1996，5(1):797-799.

［4］王鳳仙，吳振倡，郭紅櫻，等.天蘭淡紅鏈霉菌原生質(zhì)體再生株激光輻照的研究［J］.激光生物學(xué)報(bào)，1998，7(1):32-33，56 WANG Fengxian，WU Zhenchang，GUO Hongying，et al.Study of radiation in the regeneration strain of the protoplast for S.coruleorubidus with the laster［J］.Laster Biology，1998，7(1):32-33，56.

［5］劉輝，張慶慶，呂聞聞.復(fù)合誘變選育高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株［J］，安徽工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(3):211-213.LIU Hui，ZHANG Qingqing，LV Wenwen.Compund mutation screening of γ-aminobutyric acid high-yield strain ［J］.Journal of Anhui Polytechnic University，2011，26(3):211-213.