蔡 文，譚興和1，* ，張 喻1，，王 鋒1，，張春艷1，，鄧潔紅1，

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128;2.柑桔資源綜合利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南 長沙 410128)

油炸薯片是深受大眾喜愛的休閑食品之一，但是該淀粉類食品在高溫加工條件下容易產(chǎn)生丙烯酰胺，薯片因含水率低使其產(chǎn)生的丙烯酰胺遠遠高于其它高溫油炸產(chǎn)品［1，2］。丙烯酰胺是世界公認的有毒有害物質(zhì)，具有致癌性、神經(jīng)毒性、基因毒性、遺傳毒性［3-6］。過量攝入含有丙烯酰胺的食品，可能會對人們的健康造成威脅［7］。因此，減少或抑制食品中丙烯酰胺的生成是食品安全領域的重要課題。目前丙烯酰胺的檢測分析方法應用較多的主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［8，9］。利用 GC-MS 檢測丙烯酰胺，需要對分析物進行衍生化處理，操作復雜，相對費時。LC-MS/MS法雖然無需衍生化處理，但是科研投入較大，不利于在實驗室普及。薯片中的丙烯酰胺含量容易超標，具有研究代表性。目前關于高效液相色譜法測定丙烯酰胺含量的研究中，專門針對油炸復合薯片進行系統(tǒng)研究的不多。復合薯片基質(zhì)復雜，提取液去油脂、蛋白質(zhì)等前處理后進樣分析，色譜圖中丙烯酰胺峰受雜峰影響大，導致目標峰峰形不好或難以與雜峰分離，需要進一步凈化處理。因此，本研究旨在通過固相萃取小柱與高效液相色譜聯(lián)用，采用二極管陣列檢測器測定復合薯片中的丙烯酰胺含量，建立一種經(jīng)濟、穩(wěn)定可靠、成本較低的丙烯酰胺高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2995光電二極管陣列檢測器、Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent TC-C18高效 Reliance保護柱(4.6 mm × 12.5 mm，5 μm)、Agilent TC-C18柱芯、密理博明澈-D24UV超純水機、賽多利斯BS224S型電子天平、Eppendorf 5804 R臺式冷凍離心機、SKY-200B型蘇坤氣浴搖床、友田YZ-1531-B 1.5L控溫油炸鍋、壓片機、Eppendorf移液槍(0-100 μL、100-1000 μL、1000-5000 μL)、Waters Oasis HLB 固相萃取小柱(200 mg/6cc)、希波氏 0.45 μm 尼龍針筒過濾器。

1.2 材料與試劑

大西洋馬鈴薯:采自湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院實驗基地。

棕櫚油:產(chǎn)自中儲糧油脂工業(yè)東莞有限公司，購自湖南長沙市高橋大市場。

丙烯酰胺標準品(色譜級，濃度為1000 mg/L，體積為1 mL，購自 AccuStandard公司)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜級)、正己烷(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純)、硫酸鋅(分析純)、試驗用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 油炸復合薯片的制作工藝及操作要點［10］

新鮮馬鈴薯→清洗→機械去皮→蒸熟(100℃，15 min)→切片(厚度約3.0 mm)→隧道干燥箱干燥(60℃，10 h)→粉碎→過篩(80目)→配料→加水(40%，以馬鈴薯顆粒全粉質(zhì)量計)→和粉→壓片(厚度為1 mm)→切片(直徑為5.0 cm)→油炸至金黃色(170℃，50 s)→出鍋→瀝油→研磨待測。

1.3.2 丙烯酰胺標準溶液的配制 將濃度為1000 mg/L丙烯酰胺標準溶液配制成2 mg/L的標準貯備液，置于棕色瓶中，貯藏在冰箱中冷藏備用。用該貯備液配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 五個不同濃度的丙烯酰胺標準溶液。

1.3.3 樣品前處理［11，12］準確稱取 5.0000 g 粉碎均勻的復合薯片樣品于50 mL的錐形瓶中，加入一定體積的提取溶劑和蛋白質(zhì)沉淀劑，漩渦震蕩20 min后在低溫冷凍離心機上以10000 r/min離心20 min，過濾除去油層取濾液約5 mL至分液漏斗中，用正己烷以1∶1萃取兩次。將水相液過0.45 μm微孔濾膜，再取2 mL濾液過經(jīng)預先處理的固相萃取小柱(預處理是先用3 mL甲醇通過小柱，然后讓3 mL超純水通過小柱)，待樣液全部通過小柱后用洗脫液洗脫，棄去最初0.5 mL流出液后收集濾液用于液相分析。

式中，X為樣品中丙烯酰胺的含量(mg/kg);C為對應標準曲線中丙烯酰胺的含量(mg/L);V為樣品提取液的總體積(mL);M為樣品的質(zhì)量(g)。

2 結果與分析

2.1 丙烯酰胺測定條件的確定

將丙烯酰胺標準溶液在190-210 nm波長范圍進樣分析，發(fā)現(xiàn)在190-200 nm之間目標峰的峰面積隨波長的增加逐漸增大，然后逐漸減小。綜合考慮流動相各成分的截止吸收波長，確定檢測波長為210 nm。分別以不同的流動相比例、流速、柱溫、進樣量分析丙烯酰胺標準溶液和樣品溶液，綜合各色譜曲線中目標峰的峰形、保留時間等因素，最終選定流動相為甲醇/水(5∶95;V/V)、流速為 0.6 mL/min、柱溫為30℃、進樣量為10 μL。在此條件下，色譜峰峰形良好，保留時間合理。丙烯酰胺標準溶液色譜峰圖如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺標準液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of acrylamide standards

2.2 丙烯酰胺標準曲線的建立及檢測限

在最佳色譜檢測條件下將系列標準溶液進樣，以色譜峰的峰面積為縱坐標，以對應的丙烯酰胺濃度為橫坐標進行線性回歸分析，得線性回歸方程:Y=9.90 × 104X-1.57 ×103，相關系數(shù)為 0.9993，在0.2～1.0 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。再將丙烯酰胺標準溶液分別稀釋至一定程度進樣分析，結果顯示濃度為0.01 mg/L時儀器能較好地檢出，由此可知該儀器及檢測方法的最低檢測限小于10 ng/mL，該檢測限范圍及線性關系能夠滿足本試驗的分析要求。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

試驗中比較了不經(jīng)固相萃取小柱處理和經(jīng)過處理的樣品液進樣分析后的色譜圖，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)固相萃取小柱凈化處理的色譜圖中雜峰較少，峰的分離度大大提高。參考相關文獻［13，14］，選取 Oasis HLB固相萃取小柱對樣品液進行凈化處理。

圖2 丙烯酰胺在HLB柱上的水洗脫曲線Fig.2 Elution curve of acrylamide by water on HLB cartridge

試驗中采用不同比例的甲醇/水溶液作為洗脫劑，色譜數(shù)據(jù)顯示純水洗脫時，洗脫液中的雜質(zhì)更少，丙烯酰胺回收率更高。圖2是1.0 mg/L的丙烯酰胺標準溶液在HLB柱上的洗脫曲線。由圖可見，上樣流出液中完全檢測不出丙烯酰胺，說明丙烯酰胺在HLB柱上有較好地保留。丙烯酰胺完全被洗脫需要約3 mL水。誤差分析顯示HLB柱用于樣品凈化處理穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，平均回收率達99.43%。樣品的洗脫曲線顯示，極性雜質(zhì)主要集中在最初的0.5 mL洗脫液中。因此，實際操作中，棄去最初0.5 mL流出液后收集濾液用于液相分析。樣品液色譜峰圖如圖3所示，可見目標峰峰形良好，丙烯酰胺峰與其它雜峰能夠很好地分離。

2.4 精密度試驗

將一定濃度的丙烯酰胺標準溶液進樣分析，連續(xù)測定6次。結果見表1。6次進樣峰面積平均值為96402微伏*秒，相對標準偏差(RSD)為1.19%，說明該儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

將樣品液置于室溫，分別在 0、1、2、3、4、5、6h 時進樣檢測，丙烯酰胺色譜峰的峰面積結果見表2。7次進樣峰面積平均值為13743微伏*秒，相對標準偏差(RSD)為1.32%，說明該復合薯片樣品溶液在6 h內(nèi)比較穩(wěn)定，利于實驗室中的批量處理。

表1 精密度試驗測定結果Tab.1 Results of precision experiment

圖3 樣品液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sample

表2 穩(wěn)定性試驗測定結果Tab.2 Results of stability experiment

2.6 重現(xiàn)性試驗

精密稱取6份樣品，按1.2.3進行樣品前處理后進樣檢測，測定各丙烯酰胺的含量，結果見表3。5次進樣丙烯酰胺含量平均值為0.9171 mg/kg，相對標準偏差(RSD)為1.69%，說明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 重現(xiàn)性結果Tab.3 Results of reproducibility experiment

2.7 回收率試驗

取自制油炸復合薯片樣品，加入三個不同濃度的丙烯酰胺標準品進行加標回收率試驗，每個樣品平行測定三次，計算加標回收率，結果見表4。由表可見加標回收率在80%以上。

表4 加標回收率試驗結果(n=3)Tab.4 Results of spiked recovery experiment(n=3)

3 結論

本文采用固相萃取-高效液相色譜法測定油炸復合薯片中的丙烯酰胺，樣品在0.1%的甲酸水溶液中提取，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對提取液凈化處理，能較好地去除雜質(zhì)的干擾。樣品液在流動相為甲醇/水(5∶95;V∶V)，流速為 0.6 mL/min，檢測波長為210 nm的條件下，丙烯酰胺能夠在Agilent C18反相色譜柱中得到很好地保留和分離。該方法操作簡便，精密度高，穩(wěn)定性好，加標回收率較高，符合痕量分析的要求，能夠很好地應用于復合薯片中丙烯酰胺的相關研究，以便控制食品中丙烯酰胺含量，減少丙烯酰胺對健康的危害。

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