張春艷，譚興和，* ，蘇小軍，胡秋龍，王克勤，王 鋒，熊興耀

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410006;2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128;3.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128;4.湖南農(nóng)科院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維素原料是地球上最豐富的可再生能源之一。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年大量的植物秸稈，如:油菜秸稈、稻草、玉米秸稈、麥秸稈等被丟棄或者焚燒，這樣既造成資源浪費(fèi)，又污染環(huán)境［1］。近年來(lái)，利用這些木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇得到了科研工作者的高度關(guān)注。但面臨的最大難題是如何通過(guò)各種預(yù)處理方法有效改變?cè)辖Y(jié)構(gòu)以提高水解效率。因?yàn)槟举|(zhì)纖維素原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分所組成，纖維素不僅被半纖維素和木質(zhì)素所包裹，且其本身也存在著高度結(jié)晶性使酶制劑很難與纖維素接觸［2，3］，因此，必須借助化學(xué)和物理的方法進(jìn)行預(yù)處理，破壞木質(zhì)纖維素之間的連接，降低纖維素的結(jié)晶度，脫去木質(zhì)素，增加纖維素酶系與纖維素的接觸面積，從而提高酶效率［4，5］。

不同預(yù)處理方法可以有效提高木質(zhì)纖維素原料的酶解率，如傳統(tǒng)的酸水解、堿水解、蒸汽爆破、高壓液態(tài)水、機(jī)械粉碎、微生物降解等方法對(duì)提高后續(xù)的酶解產(chǎn)糖和發(fā)酵都取得了很好的效果，但都或多或少存在一定的局限性［6-9］。γ射線輻照預(yù)處理是一種物理處理法，不需要高溫高壓等極端條件，副產(chǎn)物少，污染少，能夠有效提高酶解效率。輻照可使木質(zhì)纖維素原料分子內(nèi)形成自由基，自由基又通過(guò)一定的反應(yīng)來(lái)誘發(fā)木質(zhì)纖維素的降解，輻照還可降低纖維素聚合度，增加纖維素的活性，改變分子量的分布特性，使其分子量分布比普通纖維素更集中;還可以使纖維素的結(jié)構(gòu)松散，破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，從而使纖維素可及度提高，酶解率提高［10-12］。有研究報(bào)道，γ射線輻照處理稻草、稻殼、麥稈、玉米桿、木屑等原料可有效提高酶的可及度，從而提高酶解產(chǎn)糖率［13］。氫氧化鈉溶液的浸泡處理可以增加原料的潤(rùn)脹性，增加可及表面積，降低結(jié)晶度，打斷木質(zhì)素與碳水化合物之間的連接，破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)以促進(jìn)其降解［14］。

本文通過(guò)輻照協(xié)同氫氧化鈉預(yù)處理油菜秸稈，研究?jī)烧邊f(xié)同處理對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)三因素五水平實(shí)驗(yàn)，考察了輻照與氫氧化鈉處理的相互關(guān)系及對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響，并得出最優(yōu)化條件，為油菜秸稈的酶解產(chǎn)糖提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油菜秸稈采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所試驗(yàn)基地。秸稈采回后清洗烘干(60℃，5 d)，粉碎過(guò)40目篩。

纖維素酶購(gòu)自無(wú)錫雪梅酶制劑科技有限公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸等均為分析純?cè)噭?/p>

UV7200可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;恒溫振蕩器，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司;XS型中藥粉碎機(jī)，廣州華凱機(jī)電設(shè)備有限公司;DHG-9423A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器公司;JSM-6380LV型掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 輻照 取一定量的油菜秸稈粉末裝入500mL廣口瓶中，輻照劑量為400 kGy，劑量率為2.0 kGy/h，在自然室溫條件下照射，處理后的樣品在常溫條件下貯藏備用，輻照處理在湖南省原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所進(jìn)行，輻射鈷源強(qiáng)度為9.99×1015Bq，輻照后樣品裝于黑色塑料袋中室溫保存，待用。

1.2.2 氫氧化鈉處理 取一定量經(jīng)400 kGy輻照后的樣品于150mL三角瓶中，以1∶10的固液比，分別于0.25% ～5.25%濃度的氫氧化鈉溶液中，20～100℃溫度下反應(yīng)0.5～5.5 h時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值至中性，過(guò)濾，洗滌并收集殘?jiān)?0℃烘干24 h，4℃冰箱保存，待酶解。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析 利用響應(yīng)面(RSM，Design-Expert8.05b)軟件設(shè)計(jì)三因素五水平實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，采用中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案，共20組實(shí)驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

1.2.4 酶解 取一定量上述氫氧化鈉溶液處理后的殘?jiān)?50mL三角瓶中，以1∶30的固液比加入0.05 mol/L，PH4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，纖維素酶加入量為250 IU/g，于恒溫振蕩器中50℃，150 r/min酶解96 h，離心取上清液，稀釋至一定倍數(shù)，測(cè)定還原糖含量。

1.2.5 測(cè)定方法 還原糖含量測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)［15］;樣品表面形態(tài)采用掃描電鏡觀察。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factorsand theirlevelsforresponse surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面法在生物與化學(xué)處理中常被廣泛地利用來(lái)優(yōu)化各種復(fù)雜的工藝參數(shù)。能以較少的試驗(yàn)次數(shù)完成全面的分析研究，評(píng)價(jià)各因素的影響及交互作用，并快速確定最優(yōu)條件。通過(guò)輻照協(xié)同氫氧化鈉預(yù)處理后酶解油菜秸稈，為了得到較高產(chǎn)量的還原糖，采用響應(yīng)面法，根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)原理，本實(shí)驗(yàn)以酶解還原糖含量Y為響應(yīng)值，對(duì)輻照后的樣品氫氧化鈉處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，包括不同的氫氧化鈉濃度、不同處理溫度和不同處理時(shí)間。氫氧化鈉處理?xiàng)l件和結(jié)果如表2所示。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立數(shù)學(xué)模型方程:

2.2 模型的顯著性檢驗(yàn)

酶解總還原糖含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)值擬合情況見(jiàn)圖1，顯示預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值擬合良好。該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著，該模型決定系數(shù)(R2)為 0.9454，校正系數(shù)(R2Adj)為 0.8963(表3)，說(shuō)明此模型擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)輻照協(xié)同氫氧化鈉處理對(duì)油菜秸稈酶解產(chǎn)還原糖的結(jié)果。由此可以認(rèn)為以上提出的二次回歸方程模型是合適的，可充分地反映各變量之間的關(guān)系。

表2 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.2 Design of central composite and the results of Y

圖1 總還原糖含量的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的對(duì)應(yīng)關(guān)系Fig.1 Plot of model-predicted values against experimental values of the total reducing sugar

通過(guò)表3數(shù)據(jù)可以看出，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，A、B、AC、A2項(xiàng)對(duì)酶解還原糖含量有顯著影響，其他因素影響不顯著。即氫氧化鈉濃度、反應(yīng)溫度、氫氧化鈉濃度與反應(yīng)時(shí)間的交互作用(它們的“Prob ＞ F”值分別為 ＜0.0001、0.0006、0.0491)對(duì)酶解還原糖含量影響顯著，各因素對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響從大到小依次為氫氧化鈉濃度＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.3 響應(yīng)面交互作用分析

氫氧化鈉濃度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解還原糖含量的交互影響如圖2所示。氫氧化鈉與反應(yīng)時(shí)間之間的交互作用顯著，兩者對(duì)后續(xù)酶解產(chǎn)還原糖的影響較大。

當(dāng)氫氧化鈉濃度在較低水平時(shí)，時(shí)間的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)處于較低水平，隨著氫氧化鈉濃度的增大，時(shí)間的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)向高水平方向移動(dòng)。響應(yīng)面的響應(yīng)值在氫氧化鈉濃度3%～4%，反應(yīng)時(shí)間3.75～4.25小時(shí)范圍內(nèi)較高。說(shuō)明氫氧化鈉濃度(A)和反應(yīng)時(shí)間(C)交互效應(yīng)顯著，這與方差分析的結(jié)果吻合。

反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解還原糖含量的交互影響如圖3所示。當(dāng)溫度較低時(shí)，時(shí)間的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)也處在較低水平，而隨著溫度升高，時(shí)間的響應(yīng)面拋物曲線的最高點(diǎn)向高水平方向移動(dòng)。

當(dāng)溫度70～80℃，反應(yīng)時(shí)間在2.25 h內(nèi)，響應(yīng)面的響應(yīng)值較高。由于反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解還原糖含量影響不大，且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響效率，因此可選擇較短時(shí)間內(nèi)氫氧化鈉處理。

圖2 氫氧化鈉濃度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖含量的交互影響Fig.2 Response surface of the effect of NaOH concentration and reaction time on total reducing sugar

圖3 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖含量的交互影響Fig.3 Response surface of the effect of reaction temperature and reaction time on total reducing sugar

氫氧化鈉濃度與反應(yīng)溫度對(duì)還原糖含量的交互影響如圖4所示。在設(shè)定溫度范圍內(nèi)，還原糖含量都是隨著氫氧化鈉濃度的增加而呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。隨著反應(yīng)溫度的增加，還原糖含量也呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，只是稍顯平緩。

當(dāng)氫氧化鈉濃度在低水平時(shí)，溫度的響應(yīng)面拋物曲線的最高點(diǎn)也出于較低水平，隨著氫氧化鈉濃度增大，溫度的響應(yīng)面拋物曲線的最高點(diǎn)向高水平方向移動(dòng)。響應(yīng)面的響應(yīng)值在溫度60～70℃，氫氧化鈉濃度3%～4%范圍內(nèi)較高。

2.4 最優(yōu)條件預(yù)測(cè)及模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程，利用Design-Expert軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件，還原糖含量最高值為524.93 mg/g，此時(shí)3個(gè)因素的取值為:氫氧化鈉濃度為2.38%，反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。

圖4 反應(yīng)溫度與氫氧化鈉濃度對(duì)還原糖含量的交互影響Fig.4 Response surface of the effect of reaction temperature and NaOH concentration on total reducing sugar

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，輻照后的油菜秸稈粉末，在最佳堿解條件下，實(shí)際測(cè)得酶解總還原糖含量為528.51 mg/g。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相近，可見(jiàn)該模型可用于分析和預(yù)測(cè)輻照協(xié)同氫氧化鈉處理對(duì)油菜秸稈酶解產(chǎn)還原糖的結(jié)果。

2.5 SEM觀察輻照協(xié)同氫氧化鈉處理的油菜秸稈結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察輻照前后及輻照協(xié)同氫氧化鈉處理后的油菜秸稈粉末如圖5所示，未經(jīng)輻照處理的油菜桿，其表面光滑，但有不規(guī)則的條狀凸起，除機(jī)械破損的痕跡外，無(wú)其他明顯特征性狀，經(jīng)400 kGy輻照的油菜，其表面變得不平整，出現(xiàn)明顯的條狀裂縫，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破損，出現(xiàn)大量小面積碎片和深溝，甚至部分蜂窩狀小孔洞。說(shuō)明輻照使油菜秸稈表面結(jié)構(gòu)受到破壞，可及表面積增加，從而提高了纖維素酶的可及度和酶解效率。而經(jīng)400 kGy輻照協(xié)同一定條件下的氫氧化鈉處理后的油菜，表面出現(xiàn)的條狀裂縫變得更細(xì)，小面積碎片和深溝更多，蜂窩狀空洞結(jié)構(gòu)也更明顯，說(shuō)明輻照后的油菜在氫氧化鈉的潤(rùn)脹作用下，表面結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，可及表面積增加更明顯，因此酶的可及度更大，酶解效率更高。

3 討論

圖5 輻照協(xié)同氫氧化鈉處理的油菜秸稈粉末電鏡掃描圖Fig.5 SEM pictures of treated and untreated straw

射線輻照可以有效破壞油菜秸稈表面結(jié)構(gòu)，打斷木質(zhì)纖維素之間的交聯(lián)，增大酶解可及表面積，從而有效提高酶解還原糖產(chǎn)量，在輻照作用下，部分纖維素、半纖維素甚至直接被降解成為小分子糖，使得原料中還原糖含量增加;氫氧化鈉溶液處理可以增加原料的潤(rùn)脹性，增加可及表面積，打斷木質(zhì)纖維素素與碳水化合物之間的交聯(lián)，有利于纖維素酶進(jìn)入木質(zhì)纖維素內(nèi)部，提高酶解效率。唐洪濤等人研究發(fā)現(xiàn)［16］，輻照結(jié)合氫氧化鈉溶液浸泡處理，對(duì)玉米秸稈酶解效果的影響，認(rèn)為輻照與氫氧化鈉溶液處理具有很好的協(xié)同效果，能夠顯著提高玉米秸稈的產(chǎn)糖率。本研究得到相似結(jié)果，即輻照結(jié)合氫氧化鈉預(yù)處理對(duì)油菜秸稈酶解產(chǎn)還原糖協(xié)同效應(yīng)明顯。

利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，各因素對(duì)酶解產(chǎn)糖的影響從大到小依次為氫氧化鈉濃度＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間;得到最佳堿解條件為:氫氧化鈉濃度為2.38%，反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。試驗(yàn)驗(yàn)證的實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值524.93 mg/g相近。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，輻照協(xié)同氫氧化鈉處理能夠有效破壞油菜秸稈表面結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量孔洞和深溝結(jié)構(gòu)，從而增大酶的可及表面積，提高酶解效率。

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