林柏瀚，陳 麗，洪旭亮，肖 化，艾保全，熊建文*

(1.華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣東廣州 510006;2.廣東工業(yè)大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，廣東廣州 510006)

光動(dòng)力療法作為一種臨床治療癌癥的方法，具有靶向性好(僅將光敏劑周圍的病變細(xì)胞作為目標(biāo))以及對(duì)病患傷害小的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛地應(yīng)用于腫瘤的治療［1］。在光動(dòng)力療法中，光敏劑吸收特定波長(zhǎng)的光，將能量轉(zhuǎn)移到分子氧，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的活性氧，起到滅活癌細(xì)胞的作用［2］。5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)屬于有機(jī)酸類，是生物合成光敏劑原卟啉IX(PPIX)的前體物，是臨床上應(yīng)用最廣泛的光敏藥物，基于5-ALA的PDT(ALA-PDT)已成功用于膀胱癌、皮膚癌和食道癌等癌癥的治療［3］。然而，如何提高其對(duì)白血病腫瘤細(xì)胞的滅殺靈敏度，以及應(yīng)對(duì)多類型的癌癥仍然是ALA-PDT所迫切需要解決的問(wèn)題。

最近幾年，二氧化鈦(TiO2)憑借良好的生物相容性、環(huán)境友好性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，TiO2開(kāi)始成為一種潛在的光敏劑，應(yīng)用于PDT研究中［4-7］。在紫外光波輻照下，TiO2表面產(chǎn)生光生空穴-電子對(duì)，光生空穴能夠跟溶液中的水或者羥基反應(yīng)，生成活性氧，從而誘導(dǎo)滅活癌細(xì)胞［8，9］。研究表明，利用TiO2表面獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，通過(guò)羧基(-COOH)與TiO2表面羥基(-OH)的鍵合，可將一些帶有羧基的染料分子或者有機(jī)酸類包覆在TiO2的表面，提高 TiO2光電轉(zhuǎn)化效率，光催化效率和分散性［10-14］。因此，本文將帶有羧基的5-ALA包覆在TiO2納米顆粒的表面，并使用傅里葉紅外光、拉曼光譜以及紫外-可見(jiàn)光吸收光譜對(duì)制備的樣品進(jìn)行了表征，利用相襯顯微鏡對(duì)PDT作用前后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞無(wú)損形態(tài)學(xué)觀察。我們的目的在于利用TiO2的運(yùn)載作用提高PDT靶向作用，從而達(dá)到提高5-ALA體外滅活HL60細(xì)胞的效率，并對(duì)5-ALA/TiO2體外滅活HL60細(xì)胞作用機(jī)理作了初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

HL60細(xì)胞株，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑與儀器

TiO2(P25，德國(guó) DEGUSSA)，5-ALA(上海先輝醫(yī)藥)，CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet 6700)，激光顯微拉曼光譜儀(香港Renishaw雷尼紹)，超聲儀器(上?？茖?dǎo))，U-3010紫外可見(jiàn)光度計(jì)(日本日立)，相襯顯微鏡(天津拓普儀器)，XDS-1A倒置顯微鏡(廣州光學(xué)儀器)，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(美國(guó)Invitrogen)，LPE-1A激光功率能量計(jì)(北京物科光電)，PDT反應(yīng)室(自行設(shè)計(jì))，SW-CJ型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù))，HH.CP-TW80升二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒科技)，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子)，96孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞計(jì)數(shù)板及其他常規(guī)器皿，403 nm光源(自行設(shè)計(jì))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 5-ALA表面修飾的二氧化鈦納米顆粒(5-ALA-TiO2)的制備 在暗室條件下，稱量2.62 mg的5-ALA和3.2 mg的TiO2，分散于裝有5mL超純水的玻璃試管中，密封并震蕩搖勻，TiO2懸浮于溶液中，隨后將試管置于超聲加熱器中，40℃超聲處理4 h，使材料充分反應(yīng)。5-ALA和TiO2的混合摩爾比例為:1∶2。作為對(duì)比，在相同的條件下制備TiO2和5-ALA樣品。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HL60細(xì)胞培養(yǎng)在胎牛血清含量10%的 RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于 37℃，5%CO2，95%空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用與傳統(tǒng)的細(xì)胞活性檢測(cè)方法MTT法相比，操作方便、簡(jiǎn)潔、靈敏度高、重復(fù)性好的 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法［15，16］，以 490 nm為測(cè)量波長(zhǎng)，630 nm為參比波長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 樣品光譜分析

2.1.1 傅里葉紅外光譜與拉曼光譜分析 在樣品中，TiO2納米粒子與5-ALA分子可能的結(jié)合方式主要為兩種，一種為普通的物理附著，一種為化學(xué)結(jié)合。圖1為T(mén)iO2和5-ALA/TiO2傅里葉紅外光譜。圖1(A)為純TiO2的譜線，3350 cm-1附近為T(mén)iO2表面羥基峰，圖1(B)為表面包覆了5-ALA的TiO2的譜線，由圖可見(jiàn)，在1430 cm-1附近和1730 cm-1附近出現(xiàn)了羧酸酯(-COOTi-)特征峰，這說(shuō)明，5-ALA與TiO2表面活性較高的羥基發(fā)生了類似于羧酸和醇生成脂的反應(yīng)。此外，圖1(B)中可觀察到3350 cm-1附近的羥基峰相對(duì)圖1(A)對(duì)應(yīng)峰有所減弱，這是因?yàn)?-ALA與TiO2表面的羥基反應(yīng)，消耗了部分羥基，導(dǎo)致3350 cm-1處的峰減弱，這進(jìn)一步說(shuō)明兩者確實(shí)發(fā)生反應(yīng)。該反應(yīng)可寫(xiě)成:

這表明5-ALA與TiO2通過(guò)羧基以及羥基的鍵合成功的結(jié)合，而不是普通的物理附著。這一點(diǎn)在圖2得到了驗(yàn)證，5-ALA/TiO2的拉曼光譜中1423 cm-1附近和1728 cm-1可以很清楚地觀察到羧酸酯(-COOTi-)的特征峰。

2.1.2 紫外可見(jiàn)光光譜分析 圖3是純TiO2以及5-ALA/TiO2的紫外可見(jiàn)光吸收光譜。5-ALA與TiO2二者結(jié)合之后對(duì)TiO2在可見(jiàn)光范圍吸收的影響較為明顯，也進(jìn)一步說(shuō)明二者之間結(jié)合緊密。圖中，純TiO2在400 nm附近的吸收較弱，當(dāng)5-ALA結(jié)合在TiO2表面時(shí)，樣品在400 nm附近的吸收明顯增強(qiáng)。樣品在可見(jiàn)光范圍吸收增強(qiáng)，能夠提升樣品在可見(jiàn)光照射下的光催化活性，于是在一定程度上提高樣品滅活癌細(xì)胞的效率。

以上分析說(shuō)明了制備的樣品中5-ALA與TiO2結(jié)合緊密，并且在可見(jiàn)光范圍吸收增強(qiáng)，可作為一種新型的光敏藥物用于后續(xù)的細(xì)胞滅活實(shí)驗(yàn)。

2.2 5-ALA/TiO2介導(dǎo)的 PDT體外滅活 HL60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

圖1 TiO2和5-ALA/TiO2傅里葉紅外光譜Fig.1 The FTIR spectra of TiO2and 5-ALA/TiO2

圖2 5-ALA/TiO2的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of 5-ALA/TiO2

圖3 TiO2和5-ALA/TiO2的吸收光譜Fig.3 The absorption spectrum of TiO2and 5-ALA/TiO2

圖4 各實(shí)驗(yàn)組OD值與PDT效率Fig.4 OD value and PDT efficiency of different groups

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL60細(xì)胞接種于2塊96孔培養(yǎng)板中，編號(hào)分別為A、B，每塊培養(yǎng)板劃分為4組，分別為 Control組、TiO2組、ALA組、5-ALA/TiO2組。B板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，ALA組加適量的ALA，使培養(yǎng)液中ALA的終值濃度為1 mmol/L;TiO2組加適量的TiO2，使培養(yǎng)液中 TiO2的終值濃度為160μg/mL;5-ALA/TiO2組加適量制備好的摩爾比為1∶2的5-ALA/TiO2，使培養(yǎng)液中5-ALA終值濃度為1 mmol/L、TiO2終值濃度為2 mmol/L(160μg/mL)。放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);B板放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后接受光照(光功率5 mW/cm2，光劑量18 J/cm2，光波長(zhǎng)403±6 nm)，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí);A板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，不光照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔總體積200μL，細(xì)胞接種濃度1×105個(gè)/mL。采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。得出各組的OD值如圖4(A)。

由圖4(A)可知，在無(wú)光照情況下，5-ALA、TiO2、5-ALA/TiO2組細(xì)胞的OD值相對(duì)于各自對(duì)應(yīng)的無(wú)光照細(xì)胞組的OD值無(wú)明顯變化，這表明各組樣品對(duì)細(xì)胞沒(méi)有暗毒性;光照后，各Without radiation組細(xì)胞的OD值均高于Radiation組細(xì)胞的OD值，此外在5-ALA/TiO2作用下接受光輻照后的細(xì)胞相對(duì)成活率要低于TiO2或5-ALA單獨(dú)作用下接受光輻照后細(xì)胞的相對(duì)成活率。圖4可知，5-ALA/TiO2的滅活效率相對(duì)于5-ALA和TiO2有明顯提高，達(dá)到了77.9%。

結(jié)合前面的光譜分析，滅活效率提高的可能機(jī)理是:首先5-ALA分子與TiO2納米顆粒結(jié)合緊密，PDT實(shí)驗(yàn)中TiO2納米顆粒作為藥物載體，5-ALA易于集中作用，在小區(qū)域范圍內(nèi)5-ALA濃度增大，轉(zhuǎn)化和聚集的PpIX增多，另外在TiO2納米顆粒的牽引下，更多的5-ALA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高5-ALA的利用率，從而提高滅殺效率;其次TiO2納米顆粒吸收了較短波長(zhǎng)的光以后被激發(fā)，并將能量轉(zhuǎn)移至5-ALA，光能利用效率加大，從而提高了對(duì)HL60細(xì)胞的滅殺效率。

2.3 相襯顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)損觀研究

2.3.1 相襯顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)損觀察 利用相襯顯微鏡觀察5-ALA/TiO2作用過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化，相比掃描電鏡，相襯顯微鏡觀測(cè)是一種對(duì)細(xì)胞無(wú)損的觀察方法，無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行前期固定處理，幾乎不影響細(xì)胞，保持細(xì)胞原始狀態(tài)，利于我們初步探討5-ALA/TiO2滅活細(xì)胞的機(jī)理。圖5(A)以及圖5(E)均為PDT作用前的細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞飽滿，輪廓清晰，與周圍環(huán)境有明顯的界限，由于細(xì)胞表面平整光滑，整個(gè)細(xì)胞在視場(chǎng)中較為明亮。當(dāng)光照15分鐘時(shí)，由圖5(B)可知此時(shí)的細(xì)胞邊緣開(kāi)始模糊，細(xì)胞膜出現(xiàn)褶皺，此時(shí)細(xì)胞在視場(chǎng)中較為暗淡，這表明所制備藥物在光能的激發(fā)下開(kāi)始與細(xì)胞膜發(fā)生作用。圖5(C)光照時(shí)間30分鐘后的表面，此時(shí)細(xì)胞在視場(chǎng)中與圖5(B)中細(xì)胞一致，較為模糊暗淡，然而此時(shí)的細(xì)胞膜開(kāi)始出現(xiàn)破裂(圖中左上角處)，并且在破裂處可以看到細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，這說(shuō)明了所制備的藥物能夠有效地破壞細(xì)胞膜。光照1小時(shí)后，圖5(D)顯示細(xì)胞萎縮變形，部分成碎片。對(duì)比圖5(A)和圖5(F)可知，PDT作用后，視場(chǎng)內(nèi)的細(xì)胞明顯減少，只剩余少數(shù)細(xì)胞殘骸，其形貌與圖5(D)一致。

圖5 PDT作用前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(A:作用前的細(xì)胞;B:作用15分鐘的細(xì)胞;C:作用30分鐘的細(xì)胞;D:作用1小時(shí)的細(xì)胞;E:作用前細(xì)胞;F:作用后的細(xì)胞)Fig.5 The morphology of untreated and treated HL60 cells(A:The untreated cells;B:Cells treated by 15 minutes PDT;C:Cells treated by 30 minutes PDT;D:Cells treated by 1 hour PDT;E:The untreated cells;F:The treated cells)

2.3.2 藥物作用機(jī)理探討 以上觀察表明，隨著光照時(shí)間的增加，即光劑量的增加，藥物對(duì)光子吸收越多，與周圍環(huán)境作用產(chǎn)生的活性氧越多，于是對(duì)細(xì)胞的破壞能力就越強(qiáng)。相襯顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)損觀察表明，5-ALA/TiO2對(duì)細(xì)胞的部分作用靶點(diǎn)首先是細(xì)胞膜，藥物通過(guò)與細(xì)胞膜接觸并在光子激發(fā)下釋放活性氧，誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂，隨后細(xì)胞內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及一部分細(xì)胞器流失，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相襯顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步表明，制備的藥物能夠有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，在幾幅圖片中都可以看到細(xì)胞內(nèi)有一些細(xì)小的斑點(diǎn)，這有可能是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的部分納米粒子。

圖6 激光顯微拉曼光譜檢測(cè)圖(A:HL60細(xì)胞拉曼光譜;B:加入TiO2培養(yǎng)24 h的HL60細(xì)胞)(附圖為T(mén)iO2的拉曼光譜)Fig.6 The Micro Raman spectroscopy picture(A:The Micro Raman spectroscopy picture of HL60 cells，B:The Micro Raman spectroscopy picture of HL60 cells cultured with TiO2for 24 h)(The attached picture is the Micro Raman spectroscopy picture of TiO2)

2.3.3 激光顯微拉曼光譜儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)納米粒子 圖6(A)是HL60細(xì)胞激光顯微拉曼光譜檢測(cè)圖，6(B)是與適當(dāng)濃度TiO2一起培養(yǎng)24 h的HL60細(xì)胞的檢測(cè)圖。實(shí)驗(yàn)中，我們將激光光斑聚焦在細(xì)胞上(圖6上圖)，得到細(xì)胞的拉曼光譜(圖6下圖)。由圖A可知，HL60細(xì)胞的拉曼光譜在波數(shù)120 cm-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的峰，波數(shù) 1303.7 cm-1，1333.4 cm-1，1452.3 cm-1和 1665.9 cm-1出現(xiàn)峰。圖 B 顯示，與TiO2一起培養(yǎng)的HL60細(xì)胞拉曼光譜在圖6(A)對(duì)應(yīng)波數(shù)處附近均出現(xiàn)峰并在波數(shù)144.5 cm-1出現(xiàn)新峰，在波數(shù) 393.4 cm-1，514.2 cm-1和 638.3 cm-1位置微隆起，對(duì)比純TiO2的拉曼光譜(圖B虛線圖)，可知此時(shí)的HL60細(xì)胞內(nèi)存在TiO2納米粒子。對(duì)比A、B兩圖可知，細(xì)胞對(duì)應(yīng)峰以及TiO2對(duì)應(yīng)峰的位置均發(fā)生不同程度的偏移，并且B圖的峰強(qiáng)度得到了增強(qiáng)，這表明，加入TiO2納米粒子以后，TiO2納米粒子與HL60細(xì)胞發(fā)生一定的相互作用。以上分析可知，TiO2納米粒子在與細(xì)胞一起培養(yǎng)的過(guò)程中，能夠進(jìn)入細(xì)胞，并與細(xì)胞發(fā)生一定的相互作用。

3 結(jié)論

我們將傳統(tǒng)光敏劑5-ALA與TiO2結(jié)合，利用傅里葉紅外光譜、拉曼光譜以及吸收光譜對(duì)制備的樣品進(jìn)行表征，結(jié)果表明5-ALA與TiO2結(jié)合緊密且5-ALA提高了TiO2在可見(jiàn)光范圍的吸收;在5-ALA/TiO2介導(dǎo)的PDT體外滅活HL60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，由于TiO2納米粒子使5-ALA相對(duì)集中，提高了靶向性;5-ALA與TiO2之間的能量交換提高了光能利用率，提高了細(xì)胞滅活效率;此外，利用相襯顯微鏡對(duì)PDT過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行無(wú)損觀察，初步探討了5-ALA/TiO2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果顯示藥物首先與細(xì)胞膜發(fā)生作用，隨著輻照時(shí)間的增加，藥物對(duì)細(xì)胞膜破壞更加明顯，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PDT滅活效率達(dá)到77.9%，而激光顯微拉曼光譜檢測(cè)表明TiO2能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并與細(xì)胞發(fā)生相互作用。至于5-ALA/TiO2在細(xì)胞中的精確定位，及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的具體作用機(jī)制我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中探討。實(shí)驗(yàn)最終表明，通過(guò)表面修飾法制備的5-ALA/TiO2能夠有效抑制HL60細(xì)胞生長(zhǎng)，是治療白血病的一種潛在的光敏劑。

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