古麗莎娜·阿地里江，馮杉，米凱霞，鄧海騰

定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析ClpS在分枝桿菌耐藥中的功能

古麗莎娜·阿地里江1，馮杉1，米凱霞2，鄧海騰1

1清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教育部生物信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100084 2中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京100101

ClpS是原核生物蛋白質(zhì)降解復(fù)合物ClpAPS的重要組成成分，它可以識(shí)別某些特定的氨基酸序列并將其呈遞給ClpAP以促進(jìn)其降解。同時(shí)，ClpS也抑制了其他蛋白質(zhì)底物的降解。本研究通過(guò)在恥垢分枝桿菌中過(guò)度表達(dá)ClpS，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的重組菌株提高了利福平的抗藥性。應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們系統(tǒng)地分析了過(guò)度表達(dá)ClpS對(duì)于細(xì)菌蛋白質(zhì)組的影響，并推測(cè)出細(xì)菌抗利福平的分子機(jī)制：ClpS促進(jìn)穩(wěn)態(tài)的調(diào)整、促進(jìn)藥物沉降以及加速藥物代謝。本研究首次通過(guò)改變細(xì)菌降解復(fù)合物的相關(guān)蛋白的表達(dá)增加細(xì)菌的抗藥性，并證明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是細(xì)菌的抗藥性研究以及耐藥株篩選的重要工具。

ClpAPS蛋白降解系統(tǒng)，ClpS，利福平，定量蛋白質(zhì)組學(xué)

ClpAPS是原核生物存在于胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)和序列與真核生物的26S蛋白酶體同源。ClpAPS是大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由具有蛋白酶功能的ClpP、具有識(shí)別及去折疊底物功能的ClpA和具有進(jìn)一步調(diào)控ClpAP降解功能的ClpS組成。ClpP由兩個(gè)背向的七聚體構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)組成類似于GroEL；ClpA則是中空六聚體，其N端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識(shí)別并去折疊底物，C端結(jié)構(gòu)域則把已經(jīng)去折疊的底物傳遞給ClpP進(jìn)行降解[1-2]。ClpS與ClpA以1∶1比例形成結(jié)合的復(fù)合物，可進(jìn)一步對(duì)底物的降解過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[3-4]。

目前關(guān)于ClpS在全細(xì)胞蛋白質(zhì)降解過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制還不是很清楚，其功能研究顯示，對(duì)于某些蛋白質(zhì)底物(例如N端含有FR序列的N-end rule蛋白)ClpS具有促進(jìn)降解的功能；而對(duì)于另一些蛋白質(zhì)底物(例如C端含有ssrA標(biāo)簽的蛋白)具有抑制降解的功能[1,3-7]。通過(guò)控制ClpS的表達(dá)水平可以改變細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)的降解途徑，從而間接調(diào)控其他蛋白在細(xì)胞內(nèi)的水平。由于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)具有高度的復(fù)雜性，因此研究相關(guān)基因過(guò)表達(dá)的菌株對(duì)理解蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)在細(xì)菌生長(zhǎng)及抗藥性等方面都具有重要的價(jià)值。

利福平(Rifampicin)，化學(xué)名稱為3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亞氨基]甲基]-利福霉素，是一種廣譜性的半合成抗生素。在治療結(jié)核桿菌、麻風(fēng)病菌等其他細(xì)菌感染時(shí)，它通常與其他藥物聯(lián)合使用，如異煙肼等[8-9]。利福平通過(guò)結(jié)合DNA依賴性的RNA聚合酶來(lái)抑制細(xì)菌RNA的合成，從而達(dá)到殺菌的效果[10-11]。目前對(duì)利福平有抗性的菌株主要是基于RNA聚合酶的改變以降低與利福平的親和力[11-12]。

在本項(xiàng)研究中，我們首先在結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis K.的模式菌株恥垢分枝桿菌Mycobacterium smegmatis L.&N.中建立了過(guò)度表達(dá)ClpS的重組菌株，分析顯示過(guò)度表達(dá)ClpS的M.smegmatis增加了利福平抗藥性。進(jìn)一步利用TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在過(guò)度表達(dá)ClpS的菌中鑒定到了199個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白和117個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白。通過(guò)功能性分類和代謝途徑分析，闡述了過(guò)表達(dá)ClpS導(dǎo)致細(xì)菌利福平抗性增加的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑

質(zhì)粒pMV261、p0004s和phAE159，菌株M.smegmatis mc2155均由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR所用DNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技有限公司。分子克隆所用限制性內(nèi)切酶、T載體購(gòu)自TaKaRa寶生物公司。噬菌體包裝所用的MaxPlax packaging extract購(gòu)自Epicenter Biotechnologies公司。7H9、利福平、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)購(gòu)自Sigma公司。TMT試劑購(gòu)自Thermo公司。酶解用胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自Promega公司。其他與液質(zhì)相關(guān)的化學(xué)試劑均采自國(guó)內(nèi)，色譜純級(jí)別。

1.2 clpS敲除和過(guò)度表達(dá)菌株的構(gòu)建

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取M.smegmatis mc2155菌株基因組DNA后，使用引物4910-F和4910-R擴(kuò)增clpS(msmeg_4910)基因片段，并構(gòu)建到T載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其序列正確。具體引物序列見表1。將clpS序列亞克隆到pMV261載體上，并電轉(zhuǎn)至M.smegmatis mc2155菌株中，獲得過(guò)度表達(dá)clpS的菌株。

利用分枝桿菌噬菌體的特異轉(zhuǎn)導(dǎo)法(Mycobacteriophages in specialized transduction)敲除clpS[13]。具體步驟如下：利用4910LL和4910LR引物及4910RL和4910RR引物分別擴(kuò)增clpS基因1.2 kb的上游和下游區(qū)域，具體引物序列見表1；利用限制性內(nèi)切酶DraⅢ酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到p0004s質(zhì)粒上，所獲得的中間載體與phAE159分別利用PacⅠ酶切和連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)體外包裝獲得含有clpS上游和下游及篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因的噬菌粒，進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)移到M.smegmatis獲得相應(yīng)的噬菌體；然后將高濃度的重組噬菌體與M.smegmatis mc2155菌株共培養(yǎng)3 h后，在含有潮霉素的7H10平板上篩選。培養(yǎng)5 d后，挑選單菌落，驗(yàn)證獲得clpS敲除菌株。

表1clpS基因過(guò)表達(dá)和敲除所需擴(kuò)增引物信息Table 1Primers for overexpression and knock-out of gene clpS

1.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

配制含10%ADS、0.5%甘油和0.05%Tween 80的7H9液體培養(yǎng)基，分別在無(wú)抗性及加入10 mg/L利福平的7H9液體培養(yǎng)基中測(cè)定生長(zhǎng)曲線。野生型mc2155、敲除clpS的突變菌株及過(guò)度表達(dá)clpS菌株均按照1∶100接種量接菌，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8–1.0；將上述菌液分別稀釋至OD600為0.01，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)，約每隔4 h取1 mL菌液，測(cè)量其在600 nm處的吸光度值(Ultrospec 2 100紫外可見分光光度計(jì)GE Healthcare)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 膠內(nèi)酶解與TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)定量

分別培養(yǎng)10 mL野生菌株和10 mL clpS過(guò)度表達(dá)菌株，用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞裂解，各取40 μg的裂解蛋白在SDS-PAGE蛋白膠分離，考馬斯亮藍(lán)染色后，將膠條切為15塊，分別進(jìn)行脫色、DTT打開二硫鍵和IAM烷基化處理。在50 mmol/L NH4HCO3溶液中使用胰酶酶解蛋白過(guò)夜，之后用含1%TFA和50%ACN的NH4HCO3溶液將酶解后的肽從膠內(nèi)萃取出來(lái)，再用真空濃縮干燥儀將體積縮小。

使用Thermo公司的TMT試劑化學(xué)標(biāo)記酶解后多肽的伯氨基[14]，用以對(duì)比clpS過(guò)度表達(dá)菌株與野生型菌株在蛋白水平表達(dá)的差異譜。簡(jiǎn)單來(lái)講，TMT試劑溶解于無(wú)水乙腈之中，并加到每個(gè)酶解的產(chǎn)物中。在室溫下反應(yīng)1 h之后，用5%的羥氨終止標(biāo)記反應(yīng)。TMT標(biāo)記的肽使用C18的反相柱除鹽，并準(zhǔn)備上機(jī)Q Exactive (Thermo)。我們使用TMT2-126試劑來(lái)標(biāo)記野生型菌株蛋白酶解后所產(chǎn)生的肽，TMT2-127試劑來(lái)標(biāo)記clpS過(guò)度表達(dá)菌株蛋白酶解后所產(chǎn)生的肽。TMT2-126試劑標(biāo)記的與TMT2-127試劑標(biāo)記的肽或蛋白的比例由Proteome Discovery軟件(Thermo)所計(jì)算。

1.5LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)處理

對(duì)于LC-MS/MS分析，酶解后的產(chǎn)物或TMT標(biāo)記后的肽在納升HPLC系統(tǒng)(EASY-nLCⅡTM)上分離，梯度洗脫時(shí)間為65 min，流速為0.25 μL/min；之后直接噴射入Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀中。所用分析柱是自制的填充了C18填料(孔徑300 ?、粒徑5 μm)的石英毛細(xì)管柱(直徑75 μm，長(zhǎng)度150 mm)。流動(dòng)相A是含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B是含0.1%甲酸的乙腈溶液。Q Exactive質(zhì)譜儀由Xcalibur 2.07軟件在數(shù)據(jù)依賴性獲取(Data-dependent acquisition)模式下操控，掃描模式為在Orbitrap中(400–1 800 m/z，75 000分辨率)經(jīng)過(guò)一個(gè)全譜掃描后，緊接著有10個(gè)數(shù)據(jù)依賴性的二級(jí)質(zhì)譜掃描(碎片能量為30%HCD)。對(duì)于每個(gè)LC-MS/MS運(yùn)行的樣品，所有得到的一級(jí)和二級(jí)譜圖都被送到Proteome Discovery軟件中在M. smegmatis庫(kù)中進(jìn)行搜索。

2 結(jié)果與分析

2.1 clpS敲除菌株和clpS過(guò)度表達(dá)菌株的構(gòu)建及ClpS蛋白表達(dá)水平分析

利用分枝桿菌的噬菌體的特異轉(zhuǎn)導(dǎo)法(Mycobacteriophages in specialized transduction)獲得clpS敲除菌株。同時(shí)，將clpS構(gòu)建到pMV261獲得了clpS過(guò)度表達(dá)菌株。如圖1A插入圖片所示，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型(泳道2)相比較，過(guò)度表達(dá)clpS的菌株(泳道3)其轉(zhuǎn)錄水平明顯增高;而在敲除clpS的菌株(泳道4)檢測(cè)不到clpS基因表達(dá)。我們進(jìn)一步利用質(zhì)譜方法比較了兩株菌的ClpS蛋白表達(dá)水平。圖1展示了一個(gè)ClpS蛋白酶解產(chǎn)生的二價(jià)肽段LHAAGLATMQQDR的一級(jí)質(zhì)譜，其單同位素峰的質(zhì)核比在799.40(圖1A)；其二級(jí)質(zhì)譜b系列離子自b2至b6、y系列離子自y4至y13都能夠很好地匹配上(圖1B)。在過(guò)度表達(dá)菌株中ClpS的表達(dá)在分值及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)目上均明顯高于野生型；另外，在敲除的突變菌株中，基本找不到匹配程度或得分較好的肽段。我們的實(shí)驗(yàn)表明3種菌株中ClpS的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在著差異。

2.2 利福平對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

M.smegmatis與M.tuberculosis同屬于分枝桿菌科Mycobacteriaceae分子桿菌屬M(fèi)ycobacterium，M.smegmatis是一種條件性致病菌。M.smegmatis全基因組測(cè)序分析顯示其與M.tuberculosis在毒力基因、雙組分條件系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等方面具有較高同源性，又因?yàn)槠渖L(zhǎng)速度優(yōu)勢(shì)，M.smegmatis成為較好的M. tuberculosis標(biāo)準(zhǔn)模式菌種[15-17]。M.smegmatis細(xì)菌培養(yǎng)在7H9液體培養(yǎng)基中，通過(guò)測(cè)定600 nm處的吸光度來(lái)反映其生長(zhǎng)的程度。如圖2所示，對(duì)于野生型的菌株，大約培養(yǎng)至8–9 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h之后基本進(jìn)入平臺(tái)期。而在培養(yǎng)基中加入10 mg/L利福平后，15 h時(shí)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，30 h之后才進(jìn)入平臺(tái)期。從整個(gè)生長(zhǎng)趨勢(shì)上看，利福平的加入使野生型M.smegmatis細(xì)菌的生長(zhǎng)滯后了6–7 h。

對(duì)于clpS過(guò)表達(dá)和敲除的菌株來(lái)說(shuō)，其本身生長(zhǎng)速率慢于野生型，尤其過(guò)表達(dá)的菌株還滯后于敲除的菌株約2 h(圖2)。加入利福平后，過(guò)表達(dá)和敲除的菌株的生長(zhǎng)速率雖然同樣變慢，但其滯后的程度與野生型卻不相同：過(guò)表達(dá)菌株的滯后時(shí)間約2–3 h，敲除菌株的滯后時(shí)間則為8–9 h。說(shuō)明利福平對(duì)于clpS敲除菌株生長(zhǎng)的抑制效果最為明顯，野生型次之，clpS過(guò)表達(dá)菌株則最不敏感。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有效證明了過(guò)表達(dá)ClpS蛋白能夠提升M.smegmatis對(duì)于利福平的抗性。

2.3 過(guò)度表達(dá)clpS菌株蛋白質(zhì)組學(xué)的分析

關(guān)于ClpS的研究顯示ClpS參與調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解，因此推測(cè)過(guò)度表達(dá)ClpS可能在蛋白質(zhì)水平影響相關(guān)蛋白的細(xì)胞含量，從而影響了對(duì)利福平的抗性。為驗(yàn)證此假設(shè)，我們利用TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)地分析探究了過(guò)度表達(dá)ClpS蛋白對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)組變化的影響。

TMT標(biāo)記技術(shù)是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一項(xiàng)主要手段，通過(guò)比較二級(jí)質(zhì)譜圖中報(bào)告離子的強(qiáng)度來(lái)反映對(duì)應(yīng)肽段，以及肽段對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，圖3展示了TMT分子的結(jié)構(gòu)及標(biāo)記流程。對(duì)兩個(gè)樣品中的蛋白進(jìn)行酶解，所產(chǎn)生的肽段分別用兩種不同的TMT試劑進(jìn)行比較，同一序列的肽段在標(biāo)記后分子量相同，但在二級(jí)質(zhì)譜圖中，產(chǎn)生了兩個(gè)不同質(zhì)量的報(bào)告基團(tuán)，如126 Da和127 Da的碎片離子，這兩個(gè)碎片離子強(qiáng)度的比值代表了產(chǎn)生該肽段的蛋白在兩個(gè)樣品中的相對(duì)豐度比值。

圖2野生型(方塊)、過(guò)表達(dá)clpS菌株(圓圈)和敲除clpS菌株(三角形)在未加利福平(空心)和10 mg/L利福平(實(shí)心)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2Growth rates measured for the wild-type strain (WT,square),clpS-overexpressionstrain(4910up, circle)and clpS knock-out strain(4910down,triangle) growing in the culture medium treated with(solid)or without(hollow)10 mg/L rifampicin(R).

圖3TMT定量標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)流程示意圖(改編自Thermo Scientific TMT使用說(shuō)明圖)(A)和TMT分子同位素標(biāo)記前(B)和標(biāo)記后(C)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3Schematic of the quantitation method with TMT Isobaric Mass Tagging.(A)Experimental procedure.(B) Structure of the TMT reagent,which has three parts:the amine-reactive group to modify α-amino groups of N-terminus and the ε-amino groups of lysine residue in tryptic peptides,the mass reporter group that is used in the MS/MS spectrum for quantitation,the spacer arm that balances the mass of reporter group by incorporation of stable isotopic atoms.(C)Structures of isobaric reagents:TMT2-126 and TMT2-127,*indicates the position of13C atom. Peptides with the same sequence generated from two samples have the identical molecular weight after TMT-labeling, but they generate two reporter ions in MS/MS spectra.The intensity ratios of the reporter ions represent the relative protein rations from two samples.

以細(xì)菌鐵蛋白(Bacterioferritin)為例，圖4列出了其被TMT標(biāo)記的一段二價(jià)肽I(TMT)LLLDGLPNYQR的MS/MS二級(jí)質(zhì)譜圖，它的單同位素峰的質(zhì)核比在820.48。碎片后的b、y系列離子用于肽段序列的匹配以確定肽的序列，而TMT試劑斷裂后的報(bào)告基團(tuán)則在低質(zhì)核比的區(qū)域被檢測(cè)到。從圖上看，質(zhì)量為127.13 Da的報(bào)告基團(tuán)的強(qiáng)度是126.13 Da報(bào)告基團(tuán)強(qiáng)度的2.7倍，說(shuō)明該肽段在clpS過(guò)表達(dá)菌株中較之野生型提高了2.7倍。通過(guò)平均該蛋白所檢測(cè)到的所有二級(jí)質(zhì)譜的定量信息，即可計(jì)算出細(xì)菌鐵蛋白在過(guò)表達(dá)菌株中升高的比例(1.64倍)。

圖4 細(xì)菌鐵蛋白一段TMT標(biāo)記肽I(TMT)LLLDGLPNYQR的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4MS/MS of a TMT-labeled tryptic peptide ILLLDGLPNYQR of bacterioferritin.Samples from the WT strain were labeled with TMT2-126,while those from clpS-overexpression strain were labeled with TMT2-127.

經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們一共在M.smegmatis中鑒定到了2 000個(gè)蛋白，其中有199個(gè)上調(diào)和117個(gè)下調(diào)的蛋白。使用David軟件對(duì)有變化的蛋白進(jìn)行了功能分類(圖5)，我們發(fā)現(xiàn)變化最多的都是與細(xì)胞代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白，分別占上調(diào)和下調(diào)蛋白比例的32%和29%。其他與氧化還原和轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)的蛋白也占有相當(dāng)比例。我們選取了一些具有典型變化的上調(diào)和下調(diào)蛋白分別列于圖6和圖7中。

此外，我們對(duì)這些變化蛋白進(jìn)行了細(xì)胞位置定位，除去一些未知功能的蛋白外，大部分表達(dá)水平變化的蛋白都定位于細(xì)胞質(zhì)中，也有少數(shù)定位在細(xì)胞膜及周質(zhì)中，包括上調(diào)的23個(gè)蛋白，例如細(xì)菌鐵蛋白Bacterioferritin，以及下調(diào)的5個(gè)蛋白，例如孔蛋白MspA。

圖5 過(guò)表達(dá)clpS菌株中相比野生型上調(diào)的199個(gè)蛋白(A)和下調(diào)的117個(gè)蛋白(B)的蛋白功能分析Fig.5Functional classification of differentially expressed proteins between clpS-overexpression strain and wild-type strain.(A)199 up-regulated proteins.(B)117 down-regulated proteins.

從功能分類上看，ClpS蛋白過(guò)度表達(dá)的影響涉及到細(xì)菌生化的多種途徑及功能。首先，很多核酸結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的水平發(fā)生了變化(圖6A和7A)，它們的增多或減少注定了ClpS的變化對(duì)于細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的影響是復(fù)雜的，不一定停留在降解的層面，可能影響了一些基因的轉(zhuǎn)錄。另外，與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的分子伴侶蛋白和與氧化還原相關(guān)的酶也都有一定程度的上調(diào)(圖6B)，這對(duì)于保護(hù)蛋白并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有積極意義。而在與膜相關(guān)的蛋白中，蛋白質(zhì)的表達(dá)變化影響了細(xì)胞膜的通透性和對(duì)藥物的敏感性，例如孔蛋白MspA的下調(diào)會(huì)降低分枝桿菌屬細(xì)胞對(duì)抗生素藥物的敏感性，從而產(chǎn)生了一定的耐藥性[18-19]。

圖6 4組上調(diào)蛋白在clpS過(guò)表達(dá)菌株(灰色)與野生型(白色)的含量對(duì)比(TMT標(biāo)記定量結(jié)果)Fig.6Quantitation of selected up-regulated proteins:clpS-overexpression strain(grey)and wild-type strain(white). (A)DNA binding proteins and transcriptional regulators.(B)Chaperone proteins and oxidation-reduction related enzymes.(C)Bacterioferritin and acetyltransferases.(D)Acetyl-CoA synthesis and lipid metabolism related enzymes.

以上這些因素都有可能提升細(xì)菌對(duì)于利福平的耐藥性，然而，細(xì)菌鐵蛋白(Bacterioferritin)和一系列乙?；D(zhuǎn)移酶(Acetyltransferase)表達(dá)水平的提高，可能更為直接地導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的提升。

2.4過(guò)度表達(dá)clpS菌株抗利福平機(jī)制的推測(cè)

首先，如圖6 C所示，細(xì)菌鐵蛋白(Bacterioferritin)在ClpS過(guò)表達(dá)菌株中相比于野生型提高了1.64倍。細(xì)菌鐵蛋白主要分布在細(xì)胞膜上，由24個(gè)同源亞基構(gòu)成一個(gè)中空的高度對(duì)稱球殼狀蛋白，并包含了12個(gè)鐵卟啉(Heme B)，可以攝入、運(yùn)輸和存儲(chǔ)大量的鐵離子[20-21]。細(xì)菌鐵蛋白的增多一般暗示細(xì)菌對(duì)于鐵離子攝入的增加，而Fe3+可以和利福平形成微溶于水的復(fù)合物[22]，鐵離子的增多可以有效降低細(xì)胞內(nèi)利福平的濃度。其次，除細(xì)菌鐵蛋白外，還有3種乙?；D(zhuǎn)移酶(Acetyltransferase)有1.5至2倍的上調(diào)，這也能有助于加速利福平的代謝。除酚羥基氧化成苯醌以外，利福平的一個(gè)主要代謝途徑是一個(gè)酯官能團(tuán)水解生成25-去乙?；Ｆ剑欢恍┮阴；D(zhuǎn)移酶可以參與催化此類反應(yīng)[23-25]。乙?；D(zhuǎn)移酶的上調(diào)說(shuō)明利福平的代謝可能在一定程度上得到了加速，從而起到解毒的作用。

綜上，相比于細(xì)胞整體穩(wěn)態(tài)的提升，我們認(rèn)為，鐵離子攝入增加和利福平代謝加速，是clpS過(guò)表達(dá)菌株抗藥性增強(qiáng)的主要原因。

此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，受蛋白降解速率變慢影響，多種與氨基酸合成相關(guān)的酶也有不同程度的下調(diào)，例如圖7B列舉的乳酸乙酰合成酶(Acetolactate synthase)可以催化支鏈氨基酸的合成。另外，與脂肪酸合成和氧化相關(guān)的一些酶也分別有不同程度的上調(diào)和下調(diào)(圖6D和7A)。我們認(rèn)為利福平脫乙?；鶎?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乙酸濃度的上升，多余的乙酸用來(lái)合成乙酰輔酶A，并間接影響到了脂類代謝。如脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase)，其表達(dá)量在過(guò)表達(dá)的菌株中提升了近3倍(圖8)，說(shuō)明脂肪酸的合成可能被活化。

圖7 2組下調(diào)蛋白在clpS過(guò)表達(dá)菌株(灰色)與野生型(白色)的含量對(duì)比(TMT標(biāo)記定量結(jié)果)Fig.7Quantitation of selected down-regulated proteins:clpS-overexpression strain(grey)and wild-type strain (white).(A)Transcriptional regulators and fatty acid oxidation related enzymes.(B)Amino acid synthesis related enzymes and alcohol dehydrogenases.

3討論

ClpS是蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)ClpAPS的重要組成部分，它能夠引起細(xì)菌內(nèi)諸多蛋白水平的變化，從而改變細(xì)菌本身的性質(zhì)。本文首次報(bào)道了過(guò)表達(dá)ClpS蛋白可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)于利福平的耐藥性，并使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法系統(tǒng)地探討了過(guò)表達(dá)菌株相比野生型菌株蛋白質(zhì)組的改變，并推測(cè)ClpS對(duì)其他蛋白水平的影響不一定通過(guò)降解途徑，還會(huì)影響到一些轉(zhuǎn)錄因子的水平。

ClpS蛋白的過(guò)表達(dá)能夠引起細(xì)胞內(nèi)分子伴侶蛋白和氧化還原相關(guān)酶水平的上調(diào)，從而增強(qiáng)整個(gè)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，以提高細(xì)菌對(duì)利福平的耐藥性。此外，細(xì)菌鐵蛋白和乙酰基轉(zhuǎn)移酶水平的上升對(duì)于利福平的代謝有直接的作用：前者能夠增加鐵離子的攝入以促進(jìn)藥物沉降，后者則可以加強(qiáng)利福平的去乙?；约铀偎幬锎x。因此我們推測(cè)過(guò)表達(dá)ClpS可以促進(jìn)藥物沉降和加速藥物代謝以增加對(duì)利福平的抗藥性。而細(xì)胞膜孔蛋白MspA的下調(diào)則在一定程度上減少了細(xì)菌對(duì)利福平的攝入。圖9總結(jié)了有關(guān)ClpS過(guò)表達(dá)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)一系列的變化，無(wú)論是通過(guò)直接地調(diào)控降解途徑，還是間接地干擾轉(zhuǎn)錄水平，ClpS都會(huì)影響這些功能蛋白的水平，從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)于利福平的抗性，并在一定程度上抑制了氨基酸的合成并活躍了脂肪酸的合成過(guò)程。

綜上所述，ClpS過(guò)表達(dá)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和耐藥性。應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)ClpS過(guò)表達(dá)引起316個(gè)蛋白表達(dá)水平的變化，并推測(cè)了ClpS過(guò)表達(dá)增加耐藥性的機(jī)理。本研究為工程上研究細(xì)菌的耐藥性以及篩選新的耐藥菌株提供了一個(gè)新的思路。

圖8 脂肪酸合成酶一段TMT標(biāo)記肽A(TMT)VVFDDR的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8The MS/MS of a TMT-labeled peptide AVVFDDR of fatty acid synthase.Samples from the WT strain were labeled with TMT2-126,while those from clpS-overexpression strain were labeled with TMT2-127.

圖9 過(guò)表達(dá)ClpS蛋白導(dǎo)致的一些蛋白水平的變化以及可能導(dǎo)致的對(duì)利福平抗性增加的機(jī)理Fig.9A scheme of proposed mechanisms of drug resistance in rifampicin-treated M.smegmatis.

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Quantitative proteomics analysis of ClpS-mediated rifampicin resistance in Mycobacterium

GulishanaAdilijiang1,Shan Feng1,Kaixia Mi2,and Haiteng Deng1
1 MOE Key Laboratory of Bioinformatics,School of Life Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China 2 Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China

Adaptor protein ClpS is an essential regulator of prokaryotic ATP-dependent protease ClpAP,which delivers certain protein substrates with specific amino acid sequences to ClpAP for degradation.However,ClpS also functions asthe inhibitor of the ClpAP-mediated protein degradation for other proteins.Here,we constructed the clpS-overexpression Mycobacterium smegmatis strain,and showed for the first time that overexpression of ClpS increased the resistance of M. smegmatis to rifampicin that is one of most widely used antibiotic drugs in treatment of tuberculosis.Using quantitative proteomic technology,we systematically analyzed effects of ClpS overexpression on changes in M.smegmatis proteome, and proposed that the increased rifampicin resistance was caused by ClpS-regulated drug sedimentation and drug metabolism.Our results indicate that the changes in degradation related proteins enhanced drug resistance and quantitative proteomic analysis is an important tool for understanding molecular mechanisms responsible for bacteria drug resistance.

protein degradation system ClpAPS,ClpS,rifampicin,quantitative proteomics

February 25,2014;Accepted:June 10,2014

Haiteng Deng.Tel/Fax:+86-10-62790498;E-mail:dht@mail.tsinghua.edu.cn Kaixia Mi.Tel/Fax:+86-10-57408892;E-mail:mik@im.ac.cn

古麗莎娜·阿地里江,馮杉,米凱霞,等.定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析ClpS在分枝桿菌耐藥中的功能.生物工程學(xué)報(bào),2014, 30(7):1115?1127.

Adilijiang Gulishana,Feng S,Mi KX,et al.Quantitative proteomics analysis of ClpS-mediated rifampicin resistance in Mycobacterium.Chin J Biotech,2014,30(7):1115?1127.

Supported by:Independent Research Funds of Chinese Ministry of Education(No.2012Z02293).

教育部自主科研基金(No.2012Z02293)資助。

Received:December 12,2013;Accepted:March 28,2014

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2012CB725204),National High Technology Research and Development Program of Chnia(863 Program)(No.2012AA021505),National Natural Science Foundation of China(Nos.31070039, 31170030,51073081),Tianjin Municipal Key Program(Nos.13JCYBJC24900,13JCZDJC27800).

Corresponding author:Cunjiang Song.Tel/Fax:+86-22-23503866;E-mail:songcj@nankai.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2012CB725204)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2012AA021505)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.31070039，31170030，51073081)，天津市重點(diǎn)項(xiàng)目(Nos.13JCYBJC24900，13JCZDJC27800)資助。

時(shí)間：2013-11-27網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131127.1120.003.html