郭改改，吳紅星，劉明偉，丁琛,4，秦鈞,4，楊曉明

研究報告

四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化的差異蛋白質(zhì)組學

郭改改1,3,4，吳紅星2,3，劉明偉3，丁琛3,4，秦鈞3,4，楊曉明3

1 安徽醫(yī)科大學病理生理學教研室，安徽 合肥 230032 2 浙江大學生命科學研究院，杭州 浙江 310058 3 國家蛋白質(zhì)組學重點實驗室 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206 4 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

以四氯化碳 (Carbon tetrachloride，CCl4) 誘導小鼠肝組織纖維化為研究模型，發(fā)現(xiàn)并探討纖維化肝組織與正常肝組織在蛋白質(zhì)組水平上的差異。實驗小鼠 (C57 BL/6) 隨機分為兩組，由橄欖油和四氯化碳誘導15周，并分別對這兩組肝組織的全蛋白表達譜進行質(zhì)譜檢測，應用GO (Gene Ontology) 功能分類分析和KEGG (Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes) 信號通路的富集分析方法對鑒定到的全蛋白表達譜進行差異表達分析。在對照組和實驗組中，我們分別鑒定到17 382和20 486條特異性肽段，圖譜平均利用率大于50%，共計鑒定到蛋白4 991種 (蛋白特異性肽段個數(shù)至少為1)，其中差異表達蛋白有2 135種 (差異倍數(shù)大于或等于2)，表達上調(diào)蛋白1 264種，下調(diào)蛋白871種。纖維化肝臟組織中與細胞外基質(zhì)組成 (Extracellular matrix organization)、細胞骨架組成 (Cytoskeleton organization)、有機磷酸代謝 (Organophosphate metabolic process)、細胞定位 (Cellular localization) 和細胞組分調(diào)節(jié) (Regulation of cellular component organization) 相關(guān)蛋白的表達是上調(diào)的；另外，與小分子代謝 (Small molecule metabolic process)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運 (Protein transport) 和有機氮化合物的代謝 (Organonitrogen compound metabolic process)，以及四吡咯的合成過程 (Tetrapyrrole biosynthetic process) 有關(guān)蛋白的表達是下調(diào)的。信號通路富集分析結(jié)果表明，纖維化與VEGF和T細胞受體信號調(diào)節(jié)通路密切相關(guān)。結(jié)果提示，纖維化的形成不僅是一個復雜的信號轉(zhuǎn)導過程，更是一個炎癥與免疫相互促成的結(jié)果；增強肝實質(zhì)細胞的存活，降低相關(guān)信號的傳遞及接收都有可能對纖維化的發(fā)生和發(fā)展起到抑制效果。

四氯化碳，肝臟組織纖維化，蛋白質(zhì)組學

從世界范圍來看，飲酒、肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎是促使肝組織慢性損傷發(fā)展形成纖維化、肝硬化和肝癌的三大主要原因[1]。纖維化的肝臟組織內(nèi)細胞外基質(zhì)蛋白 (Extracellular matrix proteins，ECM) 明顯增多，例如：膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ、纖維連接蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸和蛋白多糖等，這些蛋白主要是由肝星形細胞 (Hepatic stellate cells，HSCs) 和其分化形成的肌纖維樣母細胞分泌而來[2-5]。靜止期的HSC細胞，儲存大量的維甲酸，并合成膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)，處于激活狀態(tài)下的HSC細胞，逐步分化形成肌纖維樣母細胞，胞內(nèi)儲存的維甲酸和新合成的膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)不斷減少，同時合成大量胞外基質(zhì)蛋白和α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin，α-SMA)。細胞外基質(zhì)積累最初形成結(jié)節(jié)，隨著肝組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變進而發(fā)展形成肝硬化，并伴隨肝功能障礙的產(chǎn)生[6]。

四氯化碳模型常用于肝臟纖維化治療藥物評估[1,7,8]。氧存在條件下，四氯化碳被還原，氯原子與碳原子間化學鍵發(fā)生斷裂，形成多種氧自由基，引起細胞膜、核酸、功能蛋白等大分子的過氧化反應。早在20世紀70年代，就有研究顯示肝纖維形成是一個可逆化過程[9]，Schaffner等也證明肝纖維化是慢性肝損傷發(fā)展進程中最后一個可逆化病理應答階段[10-11]。本研究以四氯化碳誘導小鼠肝臟組織纖維化為模型，探討纖維化肝臟組織與正常肝組織在蛋白質(zhì)組水平上的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

純系、雄性8周至10周齡C57 BL/6小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司) 10只，體重為 (20±2) g，隨機平均分為兩組，一組為對照組，腹部皮下注射橄欖油進行處理，另一組為實驗組，腹部皮下注射四氯化碳 (溶解于橄欖油) 進行誘導。

1.1.2 試劑

CCl4購自北京化學試劑公司，橄欖油購自Sigma公司，乙腈和水購自Avantor Performance Materials 公司，Masson染色試劑盒購自北京中山金橋公司。

1.1.3 主要儀器

Rigol-L3000高效液相色譜 (北京普源精電科技有限公司)，Nano LC-ultra高效液相色譜(Eksigent公司)，Triple-TOF 5600 Plus (AB SCIEX公司)。

1.2 方法

1.2.1 纖維化動物模型

誘導劑為含40%四氯化碳的橄欖油溶液，誘導期間一周注射兩次，第1次以每100 g小鼠體重，按0.5 mL的計量進行皮下注射，第2次以0.3 mL的計量進行注射，誘導期限為15周[12]。

1.2.2 纖維化鑒定

小鼠肝組織進行石蠟包埋與組織切片，應用Masson染色方法進行病理學鑒定[13]。

1.2.3 蛋白樣品制備、分離與質(zhì)譜鑒定

肝組織樣品0.5 g，8 mol/L Urea裂解液中充分裂解；各組中包含的5只小鼠肝臟組織分別提供80 μg蛋白樣品，合并后進行還原烷基化(共計400 μg)，加入二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT) 至終濃度為1 mmol/L，56 ℃，反應30 min；冷卻后，加入碘乙酰胺 (Iodoacetamide，IAA) 至終濃度為2 mmol/L，避光反應30 min；再次加入DTT至終濃度為1 mmol/L，避光反應15 min；向反應體系中加入1 mmol/L CaCl2、5倍體積25 mmol/L Tris (pH 8.2) 和8 μg胰蛋白酶，37 ℃，消化8–12 h。

肽段樣品首先用Rigol-L3000高效液相色譜進行第一次分離，溶液A：水-乙腈 (V∶V= 98∶2)；溶液B：水-乙腈(V∶V=2∶98)，NH3·H2O調(diào)節(jié)pH 10。色譜柱類型：AGELA C18，5 μm，150 A° 4.6 mm×250 mm；柱溫45 ℃，流速1 mL/min，液相中A在不同時間點所含比例(A/A+B) 為：95% (0 min)、88% (5 min)、78% (21 min)、68% (32 min)、10% (36 min)、95% (40 min)，每組共計接收40個級分，其中30個為有效級分。

1.2.4 蛋白質(zhì)的定性與定量

將第一次分離所得的30個級分分別溶解于100 μL溶液C中，12 000 r/min，離心10 min，取上清，相鄰3個樣品合并后進行第二次分離和蛋白鑒定，蛋白樣品上樣載量為1 μg。肽段樣品第二次分離中溶液C：水-乙腈-甲酸(V∶V∶V= 98∶1.9∶0.2)，溶液D：乙腈-水-甲酸 (V∶V∶V= 98∶1.9∶0.2)，pH 3。第二次分離中溶液C在不同時間點所含比例 (C/C+D)為：95% (0 min)、92% (5 min)、77% (21 min)、47% (55 min)、37% (65 min)、5% (75 min)，噴霧電壓2.5 kV，毛細管溫度為RT，碰撞能量為Rolling CE(系統(tǒng)根據(jù)一級質(zhì)譜信息，及預設(shè)參數(shù)自動調(diào)整)，一級采集質(zhì)量范圍：350–1 250 Da，二級采集質(zhì)量范圍：100–1 500 Da，富集柱類型：自制，填料C18，填料直徑5 μm，柱內(nèi)徑100 μm，長20 mm，分離柱類型：自制，填料C18，填料直徑3 μm，柱內(nèi)徑75 μm，長120 mm，流速：330 nL/min，系統(tǒng)柱壓：≤4 000 PSI。

搜索引擎: ProteinPilot Software Beta (4.2)，數(shù)據(jù)庫：NCBI_Mus musculus Ref-seq (34 361 proteins, updated on 07-04-2012)，一級誤差：10 ppm，二級誤差：20 ppm。

我們應用基于強度的絕對定量方法(Intensity based absolute quantification, or iBAQ)[14-15]，對鑒定到的蛋白質(zhì)進行定量，依照兩組內(nèi)iBAQ值之間的比值對特定蛋白的表達變化進行評定。

2 結(jié)果

2.1 四氯化碳誘導肝臟組織纖維化模型

隨機分配的兩組小鼠中，對照組注射橄欖油進行誘導，實驗組注射四氯化碳 (溶劑為橄欖油) 進行誘導。在肝臟組織纖維化模型建立過程中，一周期限之內(nèi)，實驗對象接受誘導劑注射次數(shù)為兩次，誘導持續(xù)時間為15周。在進行蛋白質(zhì)組學分析之前，首先對實驗組和對照組肝臟組織的纖維化程度進行病理學鑒定 (圖1A)。兩組肝組織的Masson染色結(jié)果顯示，在四氯化碳誘導小鼠的肝臟組織染色結(jié)果中，由Masson染色的膠原蛋白 (呈藍色) 明顯比對照組肝臟組織的膠原蛋白多。另外，該結(jié)果還顯示，膠原蛋白主要分布于細胞外基質(zhì)中，并且成纖維狀態(tài)存在，表明四氯化碳誘導15周致使小鼠肝臟纖維化形成 (圖1B)。

2.2 組織全蛋白表達譜分析

在進行差異表達蛋白譜分析之前，樣品首先進行高效液相色譜分離，隨后，對實驗組和對照組肝臟組織的蛋白質(zhì)表達全譜進行質(zhì)譜鑒定，其中，對照組小鼠肝臟組織全蛋白表達譜鑒定結(jié)果中，10個組分質(zhì)譜掃描譜圖的平均利用率＞50%，得到高可信度肽段共計17 382；實驗組中，譜圖的平均利用率＞50%，得到的高可信度肽段共計20 486；兩組共計鑒定到4 991種蛋白 (特異性肽段數(shù)量大于或等于1)，其中對照組鑒定到4 527種蛋白，實驗組鑒定到4 797種蛋白 (圖2A)。另外，差異表達蛋白有2 135種，實驗組中，表達上調(diào)的蛋白有1 264種 (與對照組的iBAQ比值大于或等于2)，表達下調(diào)的蛋白 (與對照組的iBAQ比值小于0.5) 有871種 (圖2B)。

2.3 差異表達蛋白譜分析

首先，我們對表達上調(diào)的1 264種蛋白和表達下調(diào)的871種蛋白進行了GO生物功能富集分析，結(jié)果顯示，表達上調(diào)的蛋白除了具有細胞外基質(zhì)組成功能 (Extracellular matrix organization)以外，還具有細胞骨架組成 (Cytoskeleton organization)、有機磷酸代謝(Organophosphate metabolic process) 的功能；另外，四氯化碳誘導組中，表達下調(diào)的蛋白在小分子代謝(Small metabolic process)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(Protein transport)和有機氮化合物的代謝 (Organonitrogen compound metabolic process) ，以及四吡咯的合成過程 (Tetr-apyrrole biosynthetic process) 有明顯的富集現(xiàn)象 (圖3A和3B，附表2)。

圖1 對照組與四氯化碳誘導組小鼠肝臟組織中全蛋白表達譜的鑒定流程 (A) 及肝臟組織纖維化病理學鑒定 (B)Fig. 1 A workflow for proteome screening of CCl4-induced and control liver (A) and pathological analysis of liver fibrosis (B).

圖2 兩組肝臟組織中全蛋白表達譜的蛋白鑒定數(shù)量 (A) 和四氯化碳誘導肝臟組織中差異表達蛋白的數(shù)量(B)Fig. 2 General view of liver proteome identified by MS platform in two groups (A) and Differentially expressed proteins in CCl4-induced mouse liver tissue compared to control group (B).

圖3 四氯化碳誘導小鼠肝臟組織中差異表達蛋白的GO_BP富集分析 (A) 及其統(tǒng)計學分析 (B) (P<0.01)Fig. 3 GO_BP enrichment analysis of differentially expressed proteins in CCl4-induced mouse liver tissue (A) and its statistical analysis (B). P＜0.01.

圖4 表達上調(diào)蛋白的信號通路富集分析（A：四氯化碳誘導小鼠組織中上調(diào)表達蛋白的KEGG信號通路富集分析；B：四氯化碳誘導小鼠肝臟組織上調(diào)表達蛋白中顯著富集通路的統(tǒng)計學分析；C：DNA復制、細胞周期和細胞外基質(zhì)-受體相互作用信號通路中鑒定到的蛋白在兩組中的表達量）Fig. 4 Enrichment analysis of signaling pathways in up-regulated proteins. (A) KEGG_pathway enrichment analysis of up regulated proteins in CCl4-induced mouse liver tissue. (B) Statistical analysis of KEGG_pathways enriched in up regulated proteins in CCl4-induced mouse liver tissue. (C) Relative abundance of identified proteins that belong to DNA replication, cell cycle and ECM-receptor interaction in two groups.

2.4 表達上調(diào)蛋白的信號通路分析

為了對纖維化肝組織代謝特征得到更進一步的認識，我們對在纖維化肝組織中差異表達蛋白調(diào)節(jié)的信號通路進行了分析，上調(diào)表達的1 264種蛋白的KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，實驗組中與VEGF、T細胞受體、B細胞受體和Toll樣受體等信號通路相關(guān)蛋白有明顯的上調(diào)趨勢 (圖4A、4B)，提示四氯化碳誘導的肝纖維化過程與免疫系統(tǒng)中天然免疫和獲得性免疫均密切相關(guān)，與Park[1]、Iredale[5]和Radaeva等[16]的研究結(jié)果相符。另外，四氯化碳誘導組中DNA復制、細胞周期和細胞外基質(zhì)-受體相互作用這3個信號通路有顯著的富集現(xiàn)象(圖4C)，提示，纖維化進程中，肝實質(zhì)細胞或是非實質(zhì)細胞經(jīng)歷了再生和增殖的過程，而這一現(xiàn)象可能與細胞外基質(zhì)-受體相互作用是相聯(lián)系的。

圖5 表達下調(diào)蛋白的信號通路分析（A：四氯化碳誘導小鼠組織中下調(diào)表達蛋白的KEGG信號通路富集分析；B：四氯化碳誘導小鼠肝臟組織下調(diào)表達蛋白中顯著富集信號通路鑒定到的蛋白數(shù)量）Fig. 5 Enrichment analysis of signaling pathways in down-regulated proteins. (A) KEGG_pathway enrichment analysis of proteins down regulated in CCl4-induced mouse liver tissue. (B) Protein identifications of down regulated pathways in CCl4-induced mouse liver tissue.

2.5 表達下調(diào)蛋白的信號通路分析

對表達下調(diào)的871種蛋白進行KEGG信號通路分析，我們發(fā)現(xiàn)，從信號通路鑒定蛋白數(shù)量上看，四氯化碳誘導組中發(fā)現(xiàn)有20種屬于剪切體的蛋白表達是下調(diào)的 (圖5A)，提示，纖維化后, 肝臟細胞內(nèi)大量功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達發(fā)生變化，這很可能與蛋白在mRNA水平的剪切結(jié)果有關(guān)。另外，從信號通路相關(guān)蛋白的鑒定概率 (Number of mapped genes) 來看，與硫胺素代謝(Thiamine metabolism)、聚糖降解(Other glycan degradation)、SNARE相關(guān)囊泡運動(SNARE interactions in vesicular transport)、?；撬岷蛠喤；撬岽x(Taurine and hypotaurine metabolism)、初級膽酸合成(Primary bile acid biosynthesis)以及泛酸與CoA的合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)通路相關(guān)蛋白的富集度都高于18%，其中在硫胺素代謝通路里的蛋白覆蓋率達到50% (圖5B)。硫胺素屬于胞內(nèi)諸多代謝酶類的輔酶[17]；硫胺 (維生素B1) 缺乏癥能夠?qū)е氯祟愄囟X區(qū)域和實驗動物模型局灶性腦壞死[18]，同時，Giada[19]等在對大鼠模型中的研究結(jié)果，也證明硫胺素缺乏會引起氧化氮的產(chǎn)生減少、血管功能異常。綜合以上研究結(jié)果顯示，纖維形成可能與肝組織和神經(jīng)細胞代謝功能異常是密切相關(guān)的，另外，血管循環(huán)系統(tǒng)的功能異常有可能與纖維形成過程相關(guān)。

3 討論

20世紀90年代至今，質(zhì)譜應用已經(jīng)從同位素發(fā)現(xiàn)和鑒定，擴展到生物研究領(lǐng)域，它的飛躍發(fā)展，使得解決大規(guī)模覆蓋生物蛋白質(zhì)組問題成為可能[20]。目前，蛋白質(zhì)組學策略中傾向于采用預分級分離和延長HPLC/MS/MS鑒定梯度的手段，來克服樣品的復雜性問題[21]，但這些常用方法實驗周期長、成本高。而本研究串聯(lián)使用高效液相反相色譜，對肽段樣品進行兩次分離，不僅使樣品復雜度得到降低，還令工作效率得到提升[22]。

我們選用四氯化碳誘導的肝纖維化模型進行研究，首次提出纖維形成不僅與VEGF信號通路相關(guān)，還與T細胞受體、B細胞受體和Toll樣受體信號通路等多個通路的激活密切聯(lián)系。同時，纖維化肝組織中，與細胞外基質(zhì)-受體相互作用有關(guān)的諸多蛋白的表達有明顯上調(diào)現(xiàn)象，因此，我們提出，纖維化形成最初可能是“纖維誘導信號”向正常組織或細胞的傳入過程，例如：肝實質(zhì)細胞壞死、炎癥細胞的聚集或是HSC細胞的過度激活，即包括細胞因子的信號傳導作用也包含膜受體的信號接收過程。因此，降低細胞外基質(zhì)與肝組織內(nèi)不同類型細胞的相互作用，中斷胞外信號向正常肝細胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)導，理論上，會對纖維化的發(fā)展起到一定的治療作用。

肝纖維化已成為威脅人類健康的重要問題之一[23]。肝臟組織受到藥物、酒精或物理等損傷后，枯否氏細胞、肝實質(zhì)細胞、膽管細胞、和T 細胞等多種細胞之間通過信號傳導作用，迅速構(gòu)成炎性微環(huán)境[24]，這種微環(huán)境刺激靜止期的肝臟星形細胞HSC分化發(fā)育形成肌纖維樣母細胞，激活的肌纖維樣母細胞具有表達平滑肌肌動蛋白 (a-SMA) 和多種胞外基質(zhì)蛋白的特性，并最終促進纖維化的形成[25-27]?？偠灾?，纖維化中出現(xiàn)不同類型細胞的異常激活與增殖現(xiàn)象，我們的研究結(jié)果首次從蛋白質(zhì)組學角度上證明，四氯化碳誘導的肝纖維化與DNA復制以及細胞周期相關(guān)蛋白的表達相關(guān)，由此得出，如果從保護肝實質(zhì)細胞的角度來進行藥物篩選，也將有可能緩解肝纖維化的進程。

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(本文責編 郝麗芳)

Differential proteome analysis of carbon tetrachlorideinduced mouse liver fibrosis

Gaigai Guo1,3,4, Hongxing Wu2,3, Mingwei Liu3,Chen Ding3,4, Jun Qin3,4, and Xiaoming Yang3
1 Department of Pathophysiology, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui, China 2 College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China 3 Beijing Proteome Research, State Key Laboratory of Proteomics, Beijing 102206, China 4 Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

To explore the differential proteome pattern in mouse fibrosis liver in comparison to wild type. Mice were fed with carbon tetrachloride or olive oil vehicle for 15 weeks. Mouse livers from both groups were collected and submitted to MS platform for proteome screening. GO (Gene Ontology) biological process and KEGG (Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes) pathway enrichment analysis were used to analyze differentially expressed proteins. As the results, we identified 17 382 and 20 486 unique peptides in control and carbon tetrachloride-induced groups, respectively. A total of 4 991 proteins (at least 1 unique peptide matched) were identified, of which 2 135 were differentially expressed (≥2 fold). In fibrosis mouse liver 1 264 proteins were up regulated and 871 proteins were down regulated. Proteins associated with DNA replication, cell cycle, ECM-receptor interaction, and splicesome were significantly increased in carbon tetrachlorideinduced group. Proteins associated with small molecule metabolic process, protein transport, organonitrogen compound metabolic process, and tetrapyrrole biosynthetic processes were down regulated in carbon tetrachloride-induced mouse liver fibrosis tissue. Bioinformatics findings showed that fibrosis was closely related to the regulation of VEGF and T cell receptor signaling pathway, and further suggested that liver fibrosis was a complex signal transduction process that many biological processes such as liver metabolism, inflammation, and immune response are involved. Based this study, we can envision that protection of protein metabolism in liver parenchymal cells and blocking of inflammatory signaling transduction may be beneficial for liver fibrosis therapy.

carbon tetrachloride, liver fibrosis, proteomics

February 25, 2014; Accepted: May 6, 2014

Xiaoming Yang. E-mail: xmyang2@nic.bmi.ac.cn Jun Qin. E-mail: jqin@bcm.edu

郭改改, 吳紅星, 劉明偉, 等. 四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化的差異蛋白質(zhì)組學. 生物工程學報, 2014, 30(7): 1105?1114.

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Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31170779).

國家自然科學基金 (No. 31170779) 資助。