王明銘，劉雪姣，賈露露，孫穎，高友鶴，李明喜

尿蛋白膜保存法與直接凍存法的成本效益分析

王明銘1,2*，劉雪姣1,3*，賈露露4,5，孫穎1，高友鶴5，李明喜1

1 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100730 2 河北省邢臺市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 邢臺 054000 3 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100029 4 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，北京 100045 5 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 病理生理學系，北京 100005

為了比較尿液蛋白PVDF膜富集保存法 (尿膜) 和尿液直接凍存法兩種方法的優(yōu)缺點。通過比較兩種方法在時間、所占空間、費用、蛋白降解程度及大樣本臨床實踐性方面的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)在所占空間、電費方面及臨床實踐性方面尿膜保存法優(yōu)于直接凍存法，而在時間及耗材花費方面直接凍存法優(yōu)于尿膜保存法。因此尿蛋白的尿膜保存法比直接凍存法有更強的實際應(yīng)用價值。

尿液蛋白，富集保存方法，成本效益分析

尿蛋白質(zhì)組學研究是人類蛋白質(zhì)組學研究的重要組成部分。尿液蛋白質(zhì)組學中主要的實驗技術(shù)包括：尿蛋白的富集、分離及質(zhì)譜鑒定三部分。高效全面的富集尿蛋白是進行后續(xù)研究的重要基礎(chǔ)。目前常用的尿蛋白保存方法為尿液直接凍存法，富集蛋白方法包括有機溶劑沉淀法、超速離心法、凍干法和超濾法等[1]。其中有機溶劑沉淀法富集的蛋白種類最多，重復性也較好，是常用的尿液蛋白質(zhì)分離和富集方法。許多研究發(fā)現(xiàn)在富集尿蛋白的有機溶劑中，綜合富集效率、富集蛋白種類及重復性等因素，丙酮沉淀法效果較佳，應(yīng)用較為普遍[2]。但上述方法步驟較繁瑣、富集時間較長，不適于處理臨床大樣本量、大體積、低蛋白濃度及含鹽高的尿液標本。因此，我們建立了一種簡便易行、節(jié)能環(huán)保的尿蛋白富集保存方法——尿膜(Urimem) 富集保存法[3]。這種方法同時解決了尿蛋白富集和保存兩個尿蛋白質(zhì)組學中的重要步驟，可將尿蛋白直接結(jié)合到PVDF膜上，長期冷凍保存。簡化了尿蛋白富集操作流程，節(jié)約了大量儲存空間，使大樣本量、大體積、低蛋白濃度的尿液蛋白儲存成為可能，成為臨床尿液蛋白質(zhì)組學的研究基礎(chǔ)。本文對尿液蛋白PVDF膜富集保存法和傳統(tǒng)直接凍存法的成本效益進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料

50 mL離心管：(Corning centristar)，超低溫冰箱：–86 ℃ ULT FREEZER(Thermo Forma公司)，低溫離心機：BECKMAN COULTERTM Avanti TMJ-25contriguge (BECKMAN公司)，0.2 μm PVDF膜：(Whatman公司) DZ-300A多功能真空封裝機，AP系列無油隔膜真空泵：(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 尿液收集

按常規(guī)留取尿液方法留取北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科2012–2013年住院患者腎活檢 (本院1 000例)前晨尿標本[4]，尿常規(guī)檢驗確定尿蛋白濃度。尿液收集后立即冷卻至4 ℃，5 000×g離心40 min去除脫落細胞、碎屑等，留取上清尿液。所有患者留取尿液前均簽署知情同意書。

1.3 尿蛋白富集及保存

1.3.1 尿液直接凍存法

由上述步驟得到尿液樣品50 mL三管直接凍存到–80 ℃冰箱中，尿蛋白富集參見文獻[4]。

1.3.2 Urimem富集保存法

放置4張圓形濾紙在真空抽濾過濾瓶上(10 cm2過濾面積)，將一張激活的PVDF膜置于濾紙上，將1 mol/L的磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.0) 7 mL加入15 mL離心尿液。真空抽吸過濾瓶并加入22 mL離心尿液，調(diào)整真空泵壓力使濾液通過PVDF膜滴下，整個過濾時間約4 min。結(jié)合蛋白的Urimem置于烤燈下約3–4 min，將干燥的膜及標簽放置在無菌密封膜中，真空密封機封口，保存在–80 ℃冰箱[3]。每例患者留取3份Urimem，編碼掃描后入庫登記 (圖1)。

1.4 評價指標

分別從兩種方法操作時間、費用、樣本占用冰箱空間等方面作成本效益分析，以最小成本分析法對兩種方法進行比較[5]。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件，兩組間計量資料分別做正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布后，兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

圖1 尿膜尿蛋白富集保存法流程圖Fig. 1 The flow chart of enrichment and preservation of urinary proteins using urimem.

2 結(jié)果與分析

兩種方法成本分析見表1。

表1 兩種方法成本分析Table 1 The analysis of two methods

2.1 所需時間

直接凍存法每次尿液收集及凍存需 (2.0± 1.5) min，Urimem法 (8.0±3.4) min/次；包括尿液過濾 (4.0±2.1) min、尿膜烤干 (3.0±1.3) min及封口 (1.0±0.5) min。

2.2 占用空間

直徑3.5 cm、高度12 cm的50 mL離心管在冰箱中所占體積為12 cm×3.14×(3.5 cm/2)2=115 cm3，1 000例患者3管尿液所占空間為115 cm3×3管×1 000例= (345.0±3.6) L。

Urimem經(jīng)過真空負壓封口后塑封袋面積為6.5 cm×10 cm=65 cm2，單張膜的厚度不足0.1 cm，1 000例患者3份Urimem所占空間為65 cm2×0.1 cm×3管×1 000例= (19.5±1.1) L。

2.3 花費

2.3.1 耗材花費

直接凍存法50 mL離心管1.7元/個，每人3個花費 (5.10±0.30) 元/人。

膜保存方法需 (22.58±0.30) 元/人。包括PVDF膜22.10元/人 (30 cm×3 m/盒，約3 000元，可用于直徑47 mm，面積10 cm2的圓形濾過膜407個，每張膜約7.37元，每人3張膜花費22.1元)，濾紙0.48元/人 (直徑12.5 cm 100張濾紙約16元/包，每次過濾尿液需用與濾過膜同樣大小的4張濾紙，每包濾紙可用100例次，每人3次可供33人，花費0.5元/人)。

2.3.2 電費

直接凍存法每人3管尿液，占用低溫冰箱體積為115 cm3×3管×1 000例=345 L，Thermo 85 L低溫冰箱 (24 h功率5 kW) 需5個。醫(yī)院平均電費0.89元/度，1 000例患者保存一年電費為5個×365 d×0.89元/度×5 kW= (8121.3±2.3) 元。

1 000例患者Urimem占用空間為65 cm2× 0.1 cm×3管×1 000例=19.5 L，保存一年電費為1個×365 d×0.89元/度×5 kW×19.5/85= (372.6±3.7) 元。

3 討論

尿液蛋白質(zhì)組學已日益受到國內(nèi)外學者的重視，與其他生物標本相比，尿液收取具有無創(chuàng)、方便、易于大量留取等優(yōu)點[6]。尿蛋白的組成主要包括血液經(jīng)腎小球濾過的蛋白，腎臟和泌尿道中細胞分泌的蛋白及脫落細胞碎片等[7]。尿蛋白質(zhì)組可以反映腎臟和泌尿生殖道功能的變化，有助于早期發(fā)現(xiàn)、診斷腎臟疾病以及治療隨訪分析[8]；另外，尿液中蛋白成分類似于血液，尿蛋白質(zhì)組檢測也可以反映其他器官的病理生理改變[9-10]；尿液可能會成為生物標志物的金礦[11]。但尿蛋白質(zhì)組受很多因素影響有較大的變異性，需大量的尿液樣本用于潛在生物標志物的臨床驗證及評估。我們建立的Urimem尿蛋白富集保存法，具有簡便易行、標本可長期保存等優(yōu)點[3,11]。剪碎的Urimem在裂解液中洗脫，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較–80 ℃和室溫下保存18 d的尿蛋白，發(fā)現(xiàn)二者電泳后蛋白條帶相同，包括白蛋白及其他尿液中的高峰度蛋白；Urimem保存的尿蛋白，在室溫、4 ℃、–20 ℃及–80 ℃ 4種不同溫度條件下呈現(xiàn)相同的蛋白條帶[3]。說明尿蛋白吸附到PVDF膜干燥后，不僅在低溫下可以長期儲存；甚至在常溫下，也能保存較長時間，Urimem可用于蛋白質(zhì)組學及疾病生物標志物的研究。但該方法與傳統(tǒng)的尿液直接凍存法的成本效益比較，還需進一步分析明確。

我們對尿液直接凍存法和尿膜法從樣本處理所需時間、樣本占用空間及花費等幾個方面進行了比較。以一年1 000例樣本量計算，尿液直接冷凍法占用的空間 (345 L)約為尿膜法(19.5 L)的17倍。我們只需1個85 L冰箱就可保存4年4 000例患者Urimem標本，采用直接凍存法一年尿液標本就需要5個冰箱來保存。采用Urimem保存尿液標本顯著減少生物樣本庫占用空間，減少了科研用地，適用于臨床長期多次隨訪，大樣本量尿蛋白的富集與保存及大數(shù)據(jù)庫的建立。

樣本處理及保存的總費用方面，尿膜法也優(yōu)于直接凍存法。盡管Urimem耗材花費為直接凍存法的4倍，但1年電費直接凍存法 (8 121.3元) 約為尿膜法 (372.6元) 的21倍。如果計算大型冰箱采購及維護管理費用，直接凍存法的支出將明顯增加；而尿膜法減少了多個冰箱采購和樣本庫維護費用，樣本保存時間越長，Urimem保存法的成本優(yōu)勢越明顯。

雖然樣本處理時間尿膜法比直接凍存法略長，但與直接凍存比較，Urimem富集保存尿蛋白還具有蛋白降解率低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。為防止細菌繁殖及尿蛋白降解變性，尿液必須在短時間內(nèi)低溫凍存[12]；且低溫凍存不能完全阻止尿蛋白的降解，尿液在轉(zhuǎn)運和實驗過程中反復凍融也會加速蛋白的降解[13]；Zhou等研究顯示尿液保存在–80 ℃凍融后使蛋白降解14%，而–20 ℃則大部分蛋白會降解[14]。此外與干燥狀態(tài)相比，尿蛋白在液體環(huán)境中更易發(fā)生降解。這些均極大影響了臨床尿液蛋白質(zhì)組學研究，Urimem富集的尿蛋白可凍干保存，蛋白穩(wěn)定性提高，很好地克服了這些弊端。

尿液直接冷凍后，后續(xù)進行尿蛋白富集，傳統(tǒng)富集方法步驟繁瑣，富集蛋白所需有機試劑，均有較強的揮發(fā)性，對人體的毒副作用及對環(huán)境的污染明顯[15]；Urimem法每10 cm2PVDF膜可吸附保存20 mL尿液中的蛋白[3]，富集效率高，環(huán)保，更適于長期、大規(guī)模操作。另外，臨床樣本的收集和后續(xù)研究很可能不在同一地點，這給標本的收集和運輸帶來很大不便。而尿膜法操作簡便易行，便于運輸。

4 結(jié)論

尿蛋白的膜保存法是一種簡單經(jīng)濟的尿蛋白富集和儲存方法，和尿液直接凍存法相比，有保存時間長、占用空間小、便于運輸、操作性強等成本—效益優(yōu)點，適用于大規(guī)模尿液蛋白樣本的富集及保存。使臨床大量尿液蛋白標本的保存成為可能，為臨床尿液蛋白質(zhì)組學研究奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責編 陳宏宇)

Comparison of cost-effectiveness between urimem and direct freezing for urinary protein preservation

Mingming Wang1,2*, Xuejiao Liu1,3*, Lulu Jia4,5, Ying Sun1, Youhe Gao5, and Mingxi Li1
1 Department of Nephrology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College, Beijing 100730, China 2 Department of Nephrology, Xingtai People's Hospital, Xingtai 054000, Hebei, China 3 Department of Nephrology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029, China 4 Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China 5 Department of Physiology and Pathophysiology, National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100005, China

To compare two enrichment and preservation methods of urinary proteins, stored in polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Urimem) or direct freezing, we examined the differences between the two methods in time, space, costs of supplies and electricity, degree of protein degradation and convenience of the sample handling. The urimem method is superior in the storage space, the cost of electricity and the clinical convenience compared to the direct freezing method. However, the direct freezing method is superior in the time and the cost of supplies to the urimem method. The enrichment and preservation of urinary proteins using urimem have more cost-effective benefits compared to those of the direct freezing method.

urine proteins, enrichment and preservation methods, cost-effective analysis

February, 26, 2014; Accepted: April 14, 2014

Mingxi Li. Tel: 86-10-69155351; Fax: 86-10-69155058; Email: mingxili@hotmail.com

王明銘, 劉雪姣, 賈露露, 等. 尿蛋白膜保存法與直接凍存法的成本效益分析. 生物工程學報, 2014, 30(7): 1128–1133.

Wang MM, Liu XJ, Jia LL, et al. Comparison of cost-effectiveness between urimem and direct freezing for urinary protein preservation. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1128–1133.

Supported by: Health and the Welfare industry Research Special Funds (No. 200702008), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Twelfth Five-Year Plan Period (Nos. 2011BA110B00, 2011BA110B05).

Youhe Gao. Tel: 86-10-69156493; Fax: 86-10-65212284; Email: youhegao@163.com

*These authors contributed equally to this study.

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項基金 (No. 200702008)，“十二五”國家科技支撐計劃 (Nos. 2011BA110B00, 2011BA110B05) 資助。

時間：2014-05-28 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140099.html