馬首智，孫玉琳，趙曉航，徐平

高精度相對和絕對定量的等量異位標簽在定量蛋白質(zhì)組學研究中的新進展

馬首智1，孫玉琳1，趙曉航1，徐平2,3

1 北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021 2 軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，北京 100850 3 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

蛋白質(zhì)組學逐漸從定性研究轉(zhuǎn)向定量研究。在定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)中，相對和絕對定量的等量異位標簽 (Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 是應用最廣泛的技術(shù)之一，具有通量高、穩(wěn)定性強及不受樣品來源制約等優(yōu)點，幾乎可以對任意樣品進行標記，而且可以同時對多達8個樣品進行定量分析，有效地提高了通量。iTRAQ技術(shù)不斷改進，其定量準確性顯著提高，適用的平臺越來越多，為微生物、動物、植物、生物醫(yī)學領(lǐng)域蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾組研究創(chuàng)造了條件。文中綜述了高精度iTRAQ技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學研究中的最新發(fā)展及其應用。

定量蛋白質(zhì)組學，相對和絕對定量的等量異位標簽，定量精確度

蛋白質(zhì)組學是一門新興學科，主要目的是從整體水平上研究蛋白的組成及其生物學功能。與傳統(tǒng)生物學研究針對單個蛋白不同，蛋白質(zhì)組學同時研究數(shù)千乃至上萬個蛋白在特定生物學過程中的變化。高等生物蛋白質(zhì)組具有高度的動態(tài)范圍和復雜性，給蛋白質(zhì)組學研究帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的生物化學技術(shù)無法滿足蛋白質(zhì)組學研究的需求，需要新技術(shù)的有力支撐。蛋白質(zhì)組學技術(shù)的進步可以推動蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)展，每一次重大的技術(shù)突破都會改變蛋白質(zhì)組學研究的面貌。其中，iTRAQ是近年來新出現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)定量技術(shù)。自誕生以來，iTRAQ技術(shù)得到了不斷改進，在不同領(lǐng)域有了廣泛的應用。

1 iTRAQ技術(shù)原理

iTRAQ是美國應用生物系統(tǒng)公司 (Applied biosystems Inc, ABI) 的Ross等[1]于2004年發(fā)展的一種用于體外標記蛋白質(zhì)或多肽的試劑。以4標試劑盒為例，該組試劑由4種相同分子量的穩(wěn)定同位素標簽 (Isobaric tag) 組成。每個標簽包括肽反應基團 (Reactive group)、平衡基團(Balance group)和報告基團 (Reporter group) 等3部分 (圖1A)。肽反應基團可與多肽的N端或賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基共價連接。報告基團的分子量分別為114、115、116、117道爾頓 (Da)，平衡基團分別為31、30、29、28 Da。每個iTRAQ試劑的報告基團和平衡基團分子量加和相等，所以不同iTRAQ試劑標記的多肽在一級質(zhì)譜中分子量沒有差異，這種設計不僅可以增強質(zhì)譜信號，還可有效地減少混合樣品的復雜性。在二級質(zhì)譜中，這3個基團之間發(fā)生斷裂，平衡基團由于中性丟失不能被檢測；報告基團可以被質(zhì)譜檢測到，因而可以用報告基團區(qū)分樣品的來源。由于這些不同樣品來源但相同質(zhì)荷比的母離子可被選擇進行高能碰撞裂解，釋放出代表來源樣品的不同質(zhì)荷比的報告離子和完全一致的子離子系列。這些子離子系列包含有氨基酸序列信息，可用于蛋白質(zhì)鑒定。而這些在同一個二級譜圖中包含的報告離子的豐度代表了不同來源樣品中該特定蛋白的多少，可用于蛋白質(zhì)定量分析。

2 iTRAQ技術(shù)發(fā)展趨勢

iTRAQ技術(shù)因其獨特的技術(shù)優(yōu)勢，問世后受到了蛋白質(zhì)組學界的廣泛關(guān)注，并在應用中得以不斷地改進和優(yōu)化。iTRAQ技術(shù)包括了3個方面的發(fā)展趨勢，即通量不斷提高、適用的質(zhì)譜平臺逐漸增加以及iTRAQ的定量準確性顯著改善。

2.1 iTRAQ通量的提高

Pierce等[2]通過對分子結(jié)構(gòu)的改進，設計出可以同時標記8個樣品的iTRAQ試劑，具體結(jié)構(gòu)并未公開(圖1B)。與iTRAQ原理類似的試劑還有Thermo公司的串聯(lián)質(zhì)譜標記(Tandem mass tags, TMT)試劑[3]。TMT試劑可以同時標記6個樣品(圖1C)。不同標記試劑對蛋白鑒定的影響不同。Pichler等[4]研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下，4重iTRAQ試劑鑒定的蛋白最多，其次是TMT試劑，8重iTRAQ試劑鑒定的蛋白最少。這主要是因為不同的iTRAQ試劑分子量不同，8重iTRAQ試劑加到肽段上的分子量更高，產(chǎn)生的譜圖更復雜，導致常用的搜庫軟件，如Mascot、Sequest等搜索后給出的匹配結(jié)果變差，質(zhì)譜譜圖分值低，因而在質(zhì)控過濾時更容易被過濾掉。因此在相同的假陽性率條件下，8重iTRAQ試劑鑒定到的蛋白數(shù)量最少。

與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記(Stable isotope labeling of amino acids in culture，SILAC)技術(shù)相比，iTRAQ技術(shù)可以同時分析的樣品更多。最近美國威斯康辛大學的Coon研究小組發(fā)展出一種基于中子編碼(Neutron encoding，NeuCode)的多重蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，它考慮了由穩(wěn)定同位素原子核結(jié)合能變異引起的細微質(zhì)量差異，可根據(jù)這種細微的質(zhì)量差異實現(xiàn)不同標簽標記的區(qū)分和定量比較。將NeuCode指紋引入SILAC技術(shù)，即發(fā)展為NeuCode SILAC[5]。以賴氨酸為例，這一技術(shù)理論上可以達到39重標記。它結(jié)合了iTRAQ技術(shù)高通量和SILAC技術(shù)高精度兩方面的優(yōu)點，可能是未來iTRAQ技術(shù)發(fā)展的一個趨勢。

2.2 iTRAQ檢測平臺的發(fā)展

早期iTRAQ標記的樣品使用飛行時間質(zhì)譜(Time of flight，TOF) 進行檢測。而在離子阱質(zhì)譜(Ion trap, IT)中應用較晚，這是因為傳統(tǒng)的離子阱質(zhì)譜使用碰撞誘導解離 (Collsion induced dissociation, CID) 技術(shù)，由于四分之一效應的存在，同時也由于低質(zhì)荷比端噪音高，無法檢測低質(zhì)荷比區(qū)域的iTRAQ報告離子。Griffin等[6]引入了脈沖Q點裂解 (Pulsed Q dissociation, PQD) 技術(shù)，使IT質(zhì)譜可用于iTRAQ報告離子的檢測。更高能量碰撞解離 (Higher-energy collisional dissociation, HCD) 技術(shù)[7]的引入擴展了IT質(zhì)譜的檢測范圍，并且提高了質(zhì)譜分析精度。

2.3 iTRAQ定量準確性的改善

iTRAQ技術(shù)發(fā)展的另一個趨勢是不斷提高蛋白定量的準確性。蛋白定量時目標蛋白產(chǎn)生的報告離子容易受到雜質(zhì)離子產(chǎn)生的報告離子的干擾，導致定量準確性降低。最近2篇發(fā)表在Nature Methods上的工作采用新的質(zhì)譜方法進行iTRAQ分析，試圖解決這個問題。其中，Wenger等[8]將一級質(zhì)譜的目標離子進行電子轉(zhuǎn)移解離(Electron transfer dissociation，ETD)處理，ETD處理改善了定量效果，但并沒有完全去除干擾離子對定量的影響。在另一項研究中，Ting等[9]將蛋白用LysC酶解后進行標記，二級質(zhì)譜采用CID裂解但并不進行定量分析，而是選擇信號最強的帶有報告離子的碎片離子再進行第三級HCD裂解，通過三級質(zhì)譜產(chǎn)生的報告離子進行定量。因為雜質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子與樣品產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)荷比不同，所以很少有干擾離子能夠進入三級質(zhì)譜，從而使目標離子的定量準確度得到提高。使用已知比值(10∶1)的標準蛋白進行質(zhì)譜分析，當沒有雜質(zhì)離子干擾時，蛋白的中位比值為11.7∶1，而有雜質(zhì)離子干擾時，蛋白中位比值變?yōu)?.7∶1。如果采用三級質(zhì)譜方法，蛋白的中位比值可恢復為10.5∶1。這說明三級質(zhì)譜方法幾乎徹底去除了干擾離子對定量的影響，有效地提高了定量蛋白質(zhì)組的精度。

三級質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)后，又得到了不斷的優(yōu)化。Dayon等[10]通過將三級質(zhì)譜與氣相分離結(jié)合，并換用胰酶進行酶解，進一步提高了蛋白鑒定數(shù)量。三級質(zhì)譜方法的質(zhì)譜周期較長。對此，Wühr等[11]發(fā)展了互補TMT(Complement TMT, TMTc)的方法，根據(jù)二級質(zhì)譜中TMT試劑部分斷裂的產(chǎn)物進行定量，這些離子含有肽段和未充分裂解的TMT試劑，殘余的TMT試劑含有穩(wěn)定同位素，可以區(qū)分樣品來源并提供定量信息。這種方法可以在不增加質(zhì)譜分析時間的情況下準確定量，但并非所有的二級質(zhì)譜圖都含有合適的TMTc離子。

2.4 mTRAQ技術(shù)的引入

相對和絕對定量的不等量標簽(Mass differential tags for relative and absolute quantification，mTRAQ)技術(shù)是與iTRAQ原理類似的一種技術(shù)。與iTRAQ的差別在于mTRAQ技術(shù)的標簽并不等重(圖1D、E、F)。mTRAQ設計的最初目的是用于質(zhì)譜多反應監(jiān)測(Multiple reaction monitoring, MRM)分析，研究發(fā)現(xiàn)mTRAQ也適合鳥槍法測序[12]。隨后對質(zhì)譜、生物信息等技術(shù)的改進提升了mTRAQ分析的質(zhì)量[13-14]，擴展了mTRAQ技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學中的應用。使用2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑也可以對酶解后的肽段進行不等量標記[15]。

3 iTRAQ技術(shù)與其他技術(shù)的比較

蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)包括基于凝膠的定量技術(shù)和基于質(zhì)譜的定量技術(shù)。近年來，基于質(zhì)譜的定量技術(shù)逐漸成為主流?；谫|(zhì)譜的定量技術(shù)可分為3類：代謝標記技術(shù) (Metabolic labeling)、化學標記技術(shù) (Chemical labeling)、無標記定量技術(shù) (Label free)。3種方法的主要區(qū)別是對同位素標簽的使用不同。以SILAC為代表的代謝標記技術(shù)在細胞培養(yǎng)階段加入同位素。以iTRAQ技術(shù)為代表的化學標記技術(shù)對抽提的蛋白和多肽進行同位素標記。無標記定量技術(shù)則不使用同位素標簽。不同標記技術(shù)各有其優(yōu)缺點 (表1)。

SILAC技術(shù)要求細胞在同位素標記培養(yǎng)基中生長一段時間，不能在體外分裂的細胞無法進行SILAC標記。iTRAQ技術(shù)可以對肽段進行體外標記，因此對樣品來源沒有限制。此外，不同iTRAQ標記的肽段在一級質(zhì)譜時形成一個峰，有利于蛋白鑒定。Pütz等[16]比較了iTRAQ和SILAC技術(shù)，結(jié)果表明iTRAQ鑒定到的蛋白和差異蛋白數(shù)量更多。與SILAC相比，iTRAQ的缺點是蛋白經(jīng)過酶解后再進行標記，這個過程使得從蛋白質(zhì)提取到消化為肽段的樣品處理過程無法監(jiān)控，可能引入人為干擾，增加了實驗誤差，影響定量比較的精度。而傳統(tǒng)iTRAQ技術(shù)準確度較差，更加劇了這種定量蛋白質(zhì)組學研究的難度。

無標記定量技術(shù)對質(zhì)譜穩(wěn)定性有嚴格要求，穩(wěn)定性差的質(zhì)譜平臺難以得到有統(tǒng)計學意義的定量信息。使用iTRAQ技術(shù)可以降低對質(zhì)譜的要求，而且提高了通量。例如，Wang等[17]比較了iTRAQ技術(shù)與非標記定量技術(shù)，iTRAQ的變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)只有1.8%，而無標記定量的CV值達到了15.6%，但在測量變化倍數(shù)高的蛋白時，傳統(tǒng)的iTRAQ的準確性低于無標記定量技術(shù)。Li等[18]系統(tǒng)比較了代謝標記、化學標記(iTRAQ/TMT)和無標記定量技術(shù)。結(jié)果表明，代謝標記和化學標記的定量準確度、精確度和可重復性相當，而就定量精確性和可重復性來說，iTRAQ/TMT技術(shù)還優(yōu)于代謝標記技術(shù)。但盡管如此報道，由于代謝標記的理論定量精度更高，因此需要更為細致、精確的評價。由于不同的技術(shù)方法各有其優(yōu)缺點，可根據(jù)不同的實驗目的選擇不同的定量方法。

表1 不同蛋白定量方法比較Table 1 Comparasion of different quantification methods

4 iTRAQ技術(shù)的應用

隨著技術(shù)的進步，iTRAQ得到了越來越廣泛的應用。iTRAQ技術(shù)用于蛋白定量分析，在微生物、動物、植物、生物醫(yī)學等生物材料中都有應用；此外，iTRAQ還可以用于蛋白翻譯后修飾研究。

4.1 iTRAQ技術(shù)用于微生物材料

微生物結(jié)構(gòu)簡單，蛋白成分復雜度低，是蛋白質(zhì)組學研究的理想工具。大腸桿菌是最早應用iTRAQ技術(shù)的模式生物之一[19]。此后，iTRAQ在微生物研究中的應用不斷深入。Wang等[17]分析了高產(chǎn)油的衣藻和親本衣藻蛋白的差別，發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)油的衣藻中，參與脂肪酸合成的蛋白上調(diào)，而參與淀粉合成的蛋白下調(diào)，從而促進了油脂的生成。Rivera等[20]分析了轉(zhuǎn)錄因子CodY對葡萄球菌毒力的影響。iTRAQ分析表明CodY敲除后葡萄球菌的蛋白酶和溶血素表達升高，增加了細菌的毒力。Lee等[21]分析了膽汁鹽處理前后約氏乳桿菌蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)差異蛋白涉及脅迫響應、細胞分裂、碳水化合物代謝等，這有助于益生菌改造。此外，Komatsu等[22]將mTRAQ技術(shù)用于微生物研究，發(fā)現(xiàn)了抗菌蛋白histatin 5調(diào)控白色念珠菌線粒體蛋白質(zhì)組的信號網(wǎng)絡。此外，宏蛋白質(zhì)組指微生物群落所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)[23]，iTRAQ還可以用于宏蛋白質(zhì)組學分析。

4.2 iTRAQ技術(shù)用于動物材料

動物樣本難以直接進行代謝標記。在模式動物的研究中，iTRAQ可以有效解決樣品標記的難題。有機汞對環(huán)境造成了嚴重污染，Cuello等[24]用iTRAQ技術(shù)分析了甲基汞處理前后的斑馬魚蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)71個表達改變的蛋白，分析結(jié)果表明甲基汞影響了胚胎發(fā)育、蛋白合成、能量代謝、鈣離子穩(wěn)態(tài)等。Sun等[25]用iTRAQ技術(shù)分析了高血壓疾病模型小鼠和正常小鼠的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)ATP6-VOA1、ATP6V1D、DLD、MAO-A等4個蛋白可以有效區(qū)分疾病小鼠和正常對照。

4.3 iTRAQ技術(shù)用于植物材料

植物生長過程中經(jīng)常遭受惡劣環(huán)境，抗逆反應可以幫助植物對抗惡劣環(huán)境，對抗逆反應的研究有助于提高作物產(chǎn)量。Abdalla等[26]分析了抗旱植物維柯薩對脫水脅迫的響應，作者用模擬脫水的藥物處理植物，提取了處理前后的細胞核，使用iTRAQ技術(shù)進行定量分析，鑒定到的差異蛋白涉及信號轉(zhuǎn)導、核漿轉(zhuǎn)運、分子伴侶等。Alvarez等[27]分析了脫落酸(Abscisic acid, ABA)處理的擬南芥GPA1突變體蛋白表達變化，結(jié)果顯示ABA信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運有重要的聯(lián)系，而GPA1既在ABA信號網(wǎng)絡中發(fā)揮作用，也有獨立于ABA信號的其他功能。

4.4 iTRAQ技術(shù)用于生物醫(yī)學材料

人體組織或體液是生物標記物的主要來源。人體組織樣本或體液樣本無法在體外分裂或擴增，而且來源有限，極為珍貴，因此iTRAQ是一種理想的標記技術(shù)，在組織樣本的研究中得到了廣泛應用。

Zeng等[28]檢測了肺癌、轉(zhuǎn)移癌、不典型增生和正常組織的蛋白表達，鑒定到102個顯著變化的蛋白。后期的研究選取GSTP1、HSPB1和 CKB三個蛋白進行驗證，結(jié)果表明這3個蛋白的組合對不同病變區(qū)分的靈敏度和特異度均超過90%。Mangé等[29]從接受透析治療的患者血漿中分離高密度脂蛋白的復合體，使用iTRAQ技術(shù)鑒定相互作用蛋白，鑒定到apoC-Ⅱ、apoC-Ⅲ、serotransferrin和haptoglobin等幾個蛋白，這些蛋白可以預測患者接受透析治療時出現(xiàn)并發(fā)癥的風險。

Kang等[30]采用mTRAQ技術(shù)從結(jié)腸癌和癌旁組織中鑒定到超過3 500個蛋白。此外，mTRAQ技術(shù)還可用于血清、福爾馬林固定樣品中蛋白的鑒定[31-32]。mTRAQ與MRM技術(shù)相結(jié)合，也常用于腫瘤標志物的靶向研究[33-34]。

4.5 iTRAQ技術(shù)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾

翻譯后修飾對蛋白功能有重要的調(diào)控作用，iTRAQ結(jié)合特定的富集技術(shù)，可用于翻譯后修飾研究。Reiter等[35]純化了氧化應激條件下酵母的Pan1蛋白，酶解后用iTRAQ試劑進行標記，再富集磷酸化修飾多肽，結(jié)果表明Pan1的磷酸化修飾受到氧化應激的調(diào)控。Tian等[36]用固相萃取的方法純化血清糖基化修飾蛋白，并比較了侵襲性和非侵襲性前列腺癌患者血清糖基化修飾蛋白。結(jié)果表明Cathepsin L、Periostin和MFAP4等蛋白在侵襲性腫瘤里表達升高，這些蛋白可以作為診斷侵襲性前列腺癌的標志物。Melo-Braga等[37]用不同的親和介質(zhì)富集各種翻譯后修飾蛋白，結(jié)合iTRAQ標記和質(zhì)譜檢測，同時分析了蛋白表達譜、磷酸化修飾、糖基化修飾和乙?；揎椀淖兓Ｋ麄儚男【矶昵秩镜钠咸压ぶ需b定到3 059個蛋白，其中899個蛋白、110個磷酸化修飾位點、10個糖基化修飾位點和20個乙?；揎椢稽c在侵染前后有顯著變化。

5 展望

隨著后基因組時代的到來，對基因功能的詮釋成為生命科學領(lǐng)域研究的主要內(nèi)容。定量蛋白質(zhì)組學在這個過程中發(fā)揮了重要作用，定量蛋白質(zhì)組學通過研究與某個功能有關(guān)的一群蛋白表達差異，建立細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡，揭示生命奧秘。iTRAQ技術(shù)以其諸多優(yōu)點，在定量蛋白質(zhì)組學研究中得到廣泛應用。本實驗室正在進行的細胞死亡調(diào)控機理研究，期望采用iTRAQ技術(shù)分析調(diào)控細胞壞死的信號網(wǎng)絡，并從中發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標和化療敏感性標志物。而這一技術(shù)本身的不斷進步使其能更有效地分析生物樣本，回答各種生物學問題。將來iTRAQ技術(shù)會更廣泛地應用到生物學研究中，并極大地推動生物學研究的發(fā)展。

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(本文責編 陳宏宇)

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Recent advance in high accuracy iTRAQ for quantitative proteomics

Shouzhi Ma1, Yulin Sun1, Xiaohang Zhao1, and Ping Xu2,3
1 State Key Laboratory of Molecular O ncology, Cancer Hospital & Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China 2 Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China 3 Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China

Nowadays, proteomics focuses on quantitative analysis rather than qualitative. In the field of quantitative proteomics, Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) is one of the most widely used techniques. The advantage of iTRAQ is high throughput, high stability and free of the restriction of sample property. iTRAQ is suitable for almost all kinds of samples, and up to 8 samples can be analyzed simultaneously by commercially available kit. Along with the development of techniques, more and more mass spectrometry (MS) platforms are used in iTRAQ experiments and the accuracy of iTRAQ has been improved. iTRAQ has been applied to studies of microorganism, animal, plant, medical and protein post-translational modification. Here we review the recent progress in the development of iTRAQ and its applications in quantitative proteomics.

quantitative proteomics, isobaric tags for relative and absolute quantitation, accuracy

December 18, 2013; Accepted: January 27, 2014

Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; E-mail: xupingghy@gmail.com Xiaohang Zhao. Tel: +86-10-67709015; Fax: +86-10-87778360; E-mail: zhaoxh@cicams.ac.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA020206), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780, 91029725, 81071789), Beijing Natural Science Foundation (No. 5112012).

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