董小莉，譚寧，鄧宇珺

(1.海南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南海口570311；2.廣東省醫(yī)學科學院廣東省人民醫(yī)院廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東廣州510080)

·論著·

BNP對在體大鼠I/R損傷心肌細胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

董小莉1，譚寧2，鄧宇珺2

(1.海南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南?？?70311；2.廣東省醫(yī)學科學院廣東省人民醫(yī)院廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東廣州510080)

目的 探討腦利鈉肽對心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡的保護作用。方法將24只SD雄性大鼠隨機分入對照組(S組)、缺血/再灌注組(I/R組)、BNP0.005組及BNP0.01組，每組6只，制作在體心肌缺血再灌注模型，分別使用上述干預(yù)，再灌注結(jié)束后摘取心臟，檢測心肌標本超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(Malondiadehyde，MDA)及心肌細胞凋亡指數(shù)(Apoptotic index，AI)。結(jié)果S組、I/R組、BNP 0.005組、BNP 0.01組SOD分別為(195.78±21.45)U/mg、(84.35±9.03)U/mg、(125.66±18.06)U/mg、(161.83±15.49)U/mg；MDA分別為(2.73±0.41)nmol/mg、(7.36±0.51)nmol/mg、(4.46±0.47)nmol/mg、(3.69±0.38)nmol/mg；AI分別為(3.84±2.53)%/ (43.63±3.70)%/(22.13±2.85)%、(14.21±2.77)%。各組間SOD、MDA活力及AI差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；相較于其他組，BNP各組均具有較高的SOD活力和更低的MDA活力及AI水平(P＜0.001)，而相較于BNP 0.005組，BNP 0.01組SOD活力更高(P=0.001)，MDA活力及AI水平更低(P值分別為0.007和0.012)。結(jié)論BNP后處理可能通過減少氧自由基而對缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用，且這種保護作用可能與濃度相關(guān)。

心肌缺血再灌注損傷；腦利鈉肽；凋亡；氧化應(yīng)激

早期開通閉塞的冠狀動脈是限制和縮小急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)面積、改善左心室功能的關(guān)鍵，但大量的動物實驗和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，再灌注在改善心肌供血的同時可能加重心肌缺血所造成的損傷，即心肌缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，IRI)[1-2]。如何減輕IRI已成為心臟介入治療的重要課題。心肌缺血預(yù)處理和缺血后處理是近年來研究的重點，尤其是藥物后處理，因為其可操作性更強，可能具有的臨床意義更大而被廣泛研究。近年的研究發(fā)現(xiàn)，腦利鈉肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)在動物離體心臟及細胞水平實驗研究中具有類似于缺血預(yù)處理和后處理的抗IRI的作用，可以通過激活環(huán)磷鳥嘌呤核苷(Cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)，一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)等途徑產(chǎn)生一系列心肌保護作用，如減輕再灌注后心肌抑頓，減少心梗面積及細胞凋亡等[1-5]。而在體實驗相對于離體及細胞水平實驗可以更為準確的反映藥物在體內(nèi)的代謝及作用，但目前尚無關(guān)于BNP后處理對IRI時心肌細胞凋亡影響的在體動物實驗報道，因此本研究通過建立SD大鼠在體心肌I/R損傷模型，探討不同濃度BNP后處理對IRI時心肌細胞凋亡的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組選用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，(300±50)g，隨機分成4組，每組6只：S組、I/R組、BNP 0.005組及BN P 0.01組，各組間重量差異無統(tǒng)計學意義(F=0.051，P=0.985)。后三組分別于缺血后10 min開始經(jīng)尾靜脈恒速泵入生理鹽水、BNP 0.005 μg/(kg·min)及BNP 0.01 μg/(kg·min)直至再灌注結(jié)束。

1.2 大鼠在體心肌缺血-再灌流損傷模型建立根據(jù)參考文獻[6-11]并加以改進，建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型：在體結(jié)扎冠狀動脈前降支近段使心肌缺血35 min后放開活結(jié)再灌注120 min，實驗過程中持續(xù)心電監(jiān)護，以再灌注15 min內(nèi)ST段、T波回落＞50%作為冠狀動脈再通的指標。不符合上述心電圖標準者剔除出實驗。

1.3 檢測指標及方法每只均檢測心肌組織SOD及MDA，其中前3只兼用于檢測心肌細胞AI。檢測方法分別為黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥法及TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)法。

1.4 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較使用單因素方差分析，有顯著差異者用LSD檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SOD、MDA及AI水平比較經(jīng)單因素方差分析顯示，各組間SOD、MDA活力及AI差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。相較于其他組，BNP各組均具有較高的SOD活力和更低的MDA及AI水平；而相較于BNP 0.005組，BNP 0.01組SOD活力更高，MDA活力及AI水平更低，上述各項指標比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 各組SOD、MDA及AI(±s)

表1 各組SOD、MDA及AI(±s)

注：與BNP 0.005組比較，aP=0.001；與BNP 0.005組比較，bP=0.007；與BNP 0.005組比較abP=0.012，差異有統(tǒng)計學意義；其余各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.001)。

2.2 TUENL法檢測心肌細胞凋亡心肌冰凍切片(3 μm)TUNEL染色，激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照(400×)。正常細胞核顯示藍色熒光；凋亡細胞核顯示藍綠色熒光。S組(圖1A)僅有數(shù)個凋亡細胞，I/R組(圖1B)可見大量凋亡細胞，BNP 0.005組(圖1C)凋亡細胞較I/R組明顯減少，BNP 0.01組(圖1D)凋亡細胞減少更為明顯。

圖1 TUENL法檢心肌細胞凋亡

3 討論

目前對BNP后處理的相關(guān)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，BNP對缺血再灌注心肌的保護機制主要是BNP能與心肌特異性A型利鈉肽受體結(jié)合，通過BNP/GC/ cGMP信號通路，產(chǎn)生應(yīng)激性細胞保護作用，增強心肌抗缺血缺氧能力，從而達到減少IRI所造成的心肌細胞凋亡、心肌梗死面積及心肌抑頓等保護作用[12-13]。也有動物實驗報道BNP對心肌缺血再灌注損傷的保護作用也通過一氧化氮(NO)的途徑，使線粒體的ATP敏感性鉀通道的開放[14]而獲得。而心肌缺血再灌注時的心肌組織重新恢復(fù)血流后產(chǎn)生大量活性氧(Active oxygen，ROS)是再灌注損傷最重要的原因之一。

本實驗結(jié)果顯示：BNP后處理各組較I/R組的AI明顯下降，且AI降低幅度與BNP濃度呈正相關(guān)，提示BNP可以減少I/R時的心肌細胞凋亡，且該作用與BNP濃度相關(guān)；同時較之I/R組，BNP后處理各組SOD活性升高，MDA水平降低，提示心肌抗氧化應(yīng)激能力提高，而這種作用在高濃度BNP組中更明顯。由上述結(jié)果可得到以下結(jié)論：BNP后處理減少大鼠在體I/R心肌細胞凋亡，同時提高心肌組織SOD活性、降低MDA水平這兩個間接反映ROS水平下降的指標，提示BNP后處理可能通過減輕I/R時ROS的生成使再灌注時心肌細胞凋亡水平下降，進而減輕心肌的缺血再灌注損傷，而BNP后處理如何通過ROS途徑減少心肌細胞凋亡尚需進一步研究。

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Effect of BNP on myocardium apoptosis and oxidative stress induced by ischemia/reperfusion injury in rat.

DONG Xiao-li1,TAN Ning2,DENG Yu-jun2.1.Department of Cardiology,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Guangdong Academy of Medical Sciences,People's Hospital of Guangdong Province, Guangdong Provincial Academy of Medicine,Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effects of brain natriuretic peptide(BNP)postconditioning on myocardial apoptosis during myocardial ischemia/reperfusion injury in a rat model.MethodsTwenty four male Sprague Dawley rats were randomized into four groups:sham operation group(S group,n=6,the breast tissue was dissected without ligation of left anterior descending branch);ischemic/reperfusion group(I/R group,n=6,ischemia/reperfusion surgery by ligation of left anterior descending branch,followed by saline injected to caudal vein through syringe pump for 10 min);BNP 0.005 group(n=6,0.005 μg/(kg·min)BNP injected to caudal vein by syringe pump for 10 min after ischemia surgery);BNP 0.01 group(n=6,0.005 μg/(kg·min)BNP injected to caudal vein by syringe pump for 10 min after ischemia surgery).At the end of reperfusion,heart was harvested,and myocardium superoxide dismutase(SOD),Malondiadehyde(MDA)and Apoptotic index(AI)were detected.ResultsIn S group,I/R group,BNP 0.005 group and BNP 0.01 group,SOD levels were(195.78±21.45)U/mg,(84.35±9.03)U/mg,(125.66±18.06)U/mg,(161.83±15.49)U/mg,respectively;MDA levels were(2.73±0.41)nmol/mg,(7.36±0.51)nmol/mg,(4.46±0.47)nmol/mg,(3.69±0.38)nmol/mg, respectively;AI were(3.84±2.53)%,(43.63±3.70)%,(22.13±2.85)%,(14.21±2.77)%,respectively.The differences between the groups were all statistically significant(P＜0.001).BNP 0.005 group and BNP 0.01 group had significantly higher SOD activity,lower MDA activity and lower AI level than other groups(P＜0.001).Compared with BNP 0.005 group,BNP 0.01 group had significantly higher SOD activity(P=0.001),lower MDA activity(P=0.007)and lower AI level(P=0.012).ConclusionBNP postconditioning could reduce the oxygen free radicals level to protect the ischemia-reperfusion myocardial injury.This effect is positively correlated with BNP levels.

Myocardial ischemia-reperfusion injury;Brain natriuretic peptide(BNP);Apoptosis;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350(2014)21—3124—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1227

2014-02-15)