桂明明，武慧英，孫璐，徐亞星，趙報，李鑫，李長菲，王希東，孟頌東

1 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，新疆 烏魯木齊 830052 2中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 3中國科學院大學，北京 100049

gp96是存在于真核生物細胞內(nèi)質網(wǎng)中分子量約為96 kDa的熱休克蛋白 (又稱GRP94)[1]。它屬于HSP90家族，是胞質HSP90的旁系同源蛋白，約占細胞總蛋白的1%，在細胞各種代謝功能中都起著重要的作用[2]。gp96具有結合多肽的能力，因而在抗原加工、呈遞中發(fā)揮重要作用。內(nèi)源性或外源性抗原進入細胞后被細胞中蛋白酶體降解，通過TAP分子進入內(nèi)質網(wǎng)，進而與MHC (主要組織相容性復合物)Ⅰ類或Ⅱ類分子結合，供CD8+T細胞或CD4+T細胞識別[3]。研究表明gp96能結合進入內(nèi)質網(wǎng)中的抗原肽并將結合的抗原呈遞給 MHCⅠ類或Ⅱ類分子，在 T細胞識別抗原的過程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。gp96作為一種重要的熱休克蛋白，與多種疾病及腫瘤的發(fā)生相關[7-8]。因此，獲得特異性結合gp96的抗體檢測gp96的表達，同時作為靶向 gp96治療來抑制有關疾病和腫瘤的發(fā)生[9-11]，具有很重要的意義。

目前市場上已有的gp96抗體大都是兔源、鼠源的單克隆或多克隆抗體。而腹水法生產(chǎn)的單抗或多抗往往含有較多的宿主性成分，應用于臨床特別是體內(nèi)治療時可能引起一些麻煩(例如引起患者不適)，此外腹水法自身也無法滿足工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生及科研領域對抗體日益增長的需求。由于各種原因，研究者紛紛開展新型抗體研究來滿足對抗體的日益需求[12]。新型小分子抗體單鏈可變區(qū)片段 (scFv) 是由一彈性接頭 (Linker) 將VH和VL連接而成的兩個可變區(qū)首尾相接的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個可變區(qū)由非共價鍵形成具有抗原結合功能的Fv段，此單一肽鏈的結構既有利于表達和進行基因重組操作，又增加了Fv的穩(wěn)定性[13]。scFv抗體具有抗原結合部位的最小功能結構單位。以分子量小、體內(nèi)半衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特點而倍受關注[14]。已經(jīng)有文獻報道利用原核表達系統(tǒng)獲得了鼠源的scFv[15]和Fab[16]小分子抗體。與原核表達系統(tǒng)相比，真核表達系統(tǒng)具有遺傳操作方便、培養(yǎng)基成分簡明和適合高密度發(fā)酵等優(yōu)點；真核表達系統(tǒng)畢赤酵母具有分泌表達和二硫鍵加工等翻譯后修飾的能力。因此許多在大腸桿菌中難以表達的重組蛋白在畢赤酵母中得以成功表達。另外，由于畢赤酵母遺傳性狀穩(wěn)定、生產(chǎn)成本較低、蛋白表達量高，因此其在生物制藥業(yè)中受到越來越多的關注[17-18]。文中通過構建畢赤酵母scFv抗體pPICZα-A表達質粒進行分泌表達，獲得與 gp96特異性結合的 scFv小分子抗體，為gp96蛋白的功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體菌株、細胞株

畢赤酵母菌株X33及表達質粒pPICZα-A購自 Invitrogene公司 (美國)；大腸桿菌 DH5α、293T細胞系、人乳腺癌細胞SK-BR-3、人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞HepG2細胞為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；博萊霉素 (Zeocin)購自 Invitrogene公司 (美國)；分子量蛋白marker、PVDF膜購自 Promega公司；小鼠抗His-Tag mAb、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠 IgG-FITC為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；Anti-His- HRP為Santa Cruze Biotech產(chǎn)品；gp96兔多克隆抗體為Enzo產(chǎn)品；DMEM、1640細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Gibco公司；質粒膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自北京康為世紀公司；Anti-His-tag親和層析柱(His-Trap HP)為GE公司產(chǎn)品。

1.1.3 PCR引物

根據(jù)gp96-scFv抗體片段序列設計引物：上游 引 物 (5′-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGT GCAG-3′)，引入EcoRⅠ酶切位點；下游引物(5′-CGTCTAGATGAGTGGTGGTGGTGGTGAC C-3′)，引入XbalⅠ酶切位點和His標簽。

1.2 方法

1.2.1 gp96-scFv基因的設計及合成

根據(jù) gp96-scFv的基因序列 (GenBank Accession No. AJ252276.1)[19]，委托上海生工生物工程技術服務公司合成該基因。

1.2.2 pPICZα-gp96-scFv重組表達載體的構建

以合成的gp96-scFv基因序列為模板設計引物，利用TaqDNA聚合酶進行常規(guī)擴增反應，將擴增產(chǎn)物和pPICZα-A質粒分別用EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切，回收、連接，獲得 pPICZαgp96-scFv重組表達載體，并對其進行酶切和測序鑒定。

1.2.3 酵母菌轉化、篩選及鑒定

將上述重組質粒和空載體pPICZα-A分別用SacⅠ單酶切，用Bio-Rad電轉儀 (270 V，11 ms)將線性化后的質粒分別轉化至畢赤酵母株 X33中。取轉化菌涂布于含有 100 mg/L Zeocin的YPDS平板上，于28–30 ℃溫箱中培養(yǎng)2–3 d。將抗性篩選轉化子梯度接于含 500、800、1 000 mg/ L Zeocin的YPDS固體培養(yǎng)基上，48 h左右觀察轉化子的生長情況。挑取1 000 mg/ L Zeocin平板中單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28–30 ℃培養(yǎng)16–20 h。提取酵母菌基因組DNA，PCR鑒定目的基因是否整合成功。

1.2.4 甲醇誘導表達及鑒定

取陽性菌液接種于100 mL BMGY培養(yǎng)液中，于28–30 ℃培養(yǎng)至OD600值為2.0–6.0時，3 000 r/min離心5 min收集菌體，用適量體積的BMMY培養(yǎng)基重懸，使OD600值為1.0左右。加入甲醇溶液誘導表達使其終濃度維持在0.5%–1% (每24 h補加1次甲醇)，培養(yǎng)4 d分別在各誘導表達的時間點 (0、12、24、36、48、72、96 h) 各取1 mL發(fā)酵液，采用斑點雜交法對表達產(chǎn)物進行鑒定。

1.2.5 目的蛋白的純化和鑒定

采用Anti-His-tag親和層析柱 (His-Trap HP)對表達的scFv進行純化，具體步驟見純化試劑盒說明書。通過SDS-PAGE和Western blotting對純化目的蛋白進行鑒定。

1.3 gp96-scFv抗體生物活性的測定

1.3.1 Western blotting方法評價gp96-scFv抗體對SK-BR-3細胞gp96蛋白的檢測活性

將培養(yǎng)的 SK-BR-3細胞去培養(yǎng)基后，PBS洗2–3遍，加入500 μL預冷的細胞裂解液，置于冰上裂解1 h，收集細胞裂解液，12 000 r/min離心30 min，取上清，與SDS電泳上樣緩沖液混勻后上樣，SDS電泳3 h。然后，通過電轉移系統(tǒng)將凝膠中分離的蛋白轉印 (恒壓 100 V，95 min) 到PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，用終濃度為1 μg/mL的gp96-scFv抗體于4 ℃孵育過夜。PVDF膜經(jīng)TBST漂洗后，置于含有 1 μg/mL的小鼠抗His-Tag抗體的TBST中，4 ℃孵育4 h。PVDF膜經(jīng)TBST再次漂洗后，用1∶2 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠抗體于室溫孵育2 h。最后按Western blotting發(fā)光試劑盒的操作說明，將膠片曝光顯影觀察結果。

1.3.2 Flow cytometry方法評估gp96-scFv抗體對SK-BR-3細胞膜表面gp96的檢測活性

SK-BR-3經(jīng)0.5 mmol/L EDTA消化處理后，收集 1×106個細胞，PBS 洗兩遍。用 200 μL PBS重懸細胞，加入純化后的gp96-scFv抗體使其終濃度為100 μg/mL，輕輕混勻，4 ℃孵育1 h。用PBS洗兩遍，以200 μL的PBS將細胞重懸，加入2 μL anti-His-FITC抗體，輕輕混勻，4 ℃避光孵育 30 min，再用 PBS洗兩遍，最終用400 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀觀察結果。

1.3.3 ELISA方法評估gp96-scFv抗體對gp96蛋白的檢測活性

用于包被的 gp96蛋白從人胎盤中純化提取[20]，用包被液 (25 mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6) 倍比稀釋10 μg gp96蛋白，每孔100 μL，4 ℃包被過夜，用PBST洗滌3次 (PBST： 0.05%Tween-20的PBS，pH 7.4) 后，每孔加200 μL封閉液封閉 (封閉液：5% BSA)，置于37 ℃孵育1 h，每孔加入100 μL 1 μg/mL封閉液稀釋的gp96-scFv抗體，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后加入100 μL用封閉液稀釋的anti-His-HRP(1∶100) 抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌4次。每孔加入100 μL TMB底物液避光反應10 min后，每孔再加入 50 μL終止液 (2 mol/L硫酸)，5 min后讀取450 nm處的吸光值 (OD450)。

1.3.4 Immunofluorescence方法評估gp96-scFv抗體對MCF-7細胞膜表面gp96的檢測活性

將滅菌后的蓋玻片放入 6孔板，每孔加入3×105的 MCF-7細胞，培養(yǎng)過夜。吸去 6孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗1次。加入5% BSA的PBS封閉液 37 ℃封閉 15 min。加入純化后的gp96-scFv抗體使其終濃度為100 μg/mL，孵育1 h，PBS洗 3次。加入用封閉液稀釋后的anti-His-FITC (1∶100) 抗體避光孵育1 h。PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，吸去多聚甲醛固定液，PBS洗 3次。在載玻片上滴一滴封片劑，用鑷子輕輕夾出蓋玻片，用吸水紙將殘留的液體吸干。最后用中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果

2.1 pPICZα-gp96-scFv重組表達載體的構建及鑒定

以合成gp96-scFv抗體序列為模板，PCR擴增該基因片段，結果在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)1條約 300 bp的 DNA條帶，同預期結果相符(圖 1A)。以EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切的 PCR產(chǎn)物和pPICZα-A空載質粒連接后，再用雙酶切鑒定，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)2條分別約300 bp和 3.6 kb的 DNA條帶 (圖 1B)，與預期結果相符。

2.2 重組質粒轉化的畢赤酵母菌Mut的鑒定

在含 500、800、1 000 mg/L不同梯度的Zeocin的YPDS固體培養(yǎng)基上抗性篩選畢赤酵母轉化子，最后提取1 000 mg/L Zeocin畢赤酵母菌的基因組，PCR鑒定為陽性重組的畢赤酵母菌，PCR產(chǎn)物包含 pPICZα-A載體和 gp96-scFv基因片段，通過EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)2條大小約是300 bp和3.6 kb的DNA條帶，分別為pPICZα-A載體和 gp96-scFv基因片段，同預期分子量相符合(圖 1C)。

圖1 pPICZα-gp96-scFv重組表達載體的構建及鑒定Fig. 1 Construction and identification of pPICZα-gp96-scFv fragment recombinant plasmid. (A) The gp96-scFv fragment gene was produced by PCR from the pUC57 templates. M： DNA marker; 1–2： PCR products of gp96-scFv gene. (B) Identification of the recombinant vectors by enzyme digestion. M： DNA marker; 1： EcoR and ⅠXbalⅠdigested plasmid. (C) Identification of the Pichia pastoris colonies by PCR and enzyme digestion. M： DNA marker; 1–5： EcoRand ⅠXbalⅠdigested PCR products from positive Pichia pastoris colonies.

2.3 目的基因在畢赤酵母菌中的表達

將重組質粒轉化的畢赤酵母菌加入甲醇誘導不同時間后的培養(yǎng)上清進行斑點雜交檢測，結果顯示以pPICZα-gp96-scFv重組質粒轉化，各時間點畢赤酵母菌的培養(yǎng)上清在硝酸纖維素膜上均出現(xiàn)斑點，其中第72 h出現(xiàn)的斑點亮度最高；而空載體轉化的畢赤酵母菌各時間點的培養(yǎng)上清在硝酸纖維素膜上均未出現(xiàn)斑點(圖2A)。

2.4 目的蛋白的純化和鑒定

采用Anti-His-tag親和層析柱(His-Trap HP)對表達的gp96-scFv進行純化，純化的目的產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE檢測表明，考馬斯亮藍染色的丙烯酰胺凝膠出現(xiàn)2條分子量約為15 kDa的條帶(圖2B)。Western blotting鑒定的結果顯示，純化的目的蛋白在膠片上出現(xiàn)1條分子量為15 kDa的蛋白條帶；而空載體轉化的畢赤酵母菌發(fā)酵液作為陰性對照則沒有相應的條帶 (圖2C)，并且條帶位置同預期分子量大小基本相同。同時，將人胎盤中純化的gp96蛋白進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色的丙烯酰胺凝膠出現(xiàn)1條分子量約為96 kDa的明顯條帶，再使用商業(yè)化的gp96兔多克隆抗體或gp96-scFv抗體對人胎盤gp96蛋白和牛血清白蛋白 (BSA) 作為陰性對照進行Western blotting雜交，Western blotting結果顯示均能出現(xiàn)明顯雜交條帶 (圖2D)，結果表明純化的蛋白是96-scFv抗體，且能夠結合 gp96蛋白。

2.5 gp96-scFv抗體生物活性檢測

2.5.1 gp96-scFv抗體的Western blotting檢測

SK-BR-3細胞經(jīng)細胞裂解液處理后，分別取0、20、30 μg細胞裂解液上清進行SDS-PAGE。轉膜以后將 PVDF膜與 1 μg/mL純化后的gp96-scFv抗體4 ℃孵育過夜。最后按Western blotting發(fā)光試劑盒的操作說明，將膠片爆光顯影觀察結果。結果顯示，在膠片上出現(xiàn) 1條分子量約為96 kDa的蛋白條帶；而陰性對照則無此條帶 (圖3A)。同時，將野生型HepG2細胞和siRNA穩(wěn)定敲低gp96的HepG2細胞經(jīng)細胞裂解液處理后，分別取 30 μg上清蛋白進行 Western blotting，結果顯示 siRNA穩(wěn)定敲低 gp96細胞相對于野生型細胞條帶明顯變?nèi)?(圖3A下)，這些結果均表明96-scFv抗體能夠特異結合gp96蛋白。

圖3 gp96-scFv抗體生物活性檢測Fig. 3 Detection of the biological activities of gp96-scFv antibody. (A) Western blotting detection of endogenous gp96 in SK-BR-3 cells (up), and HepG2 cells or HepG2 cells stably transfected with gp96 RNAi (down) using gp96-scFv antibody. (up) lane 1： PBS as a negative control; 2–3： different amounts of SK-BR-3 cells lysates. (down)1： HepG2 cells lysates; 2： cell lysates of HepG2 cells stably transfected with gp96 siRNA. (B) FACS analysis of cell surface gp96 in SK-BR-3 cells using gp96-scFv antibody. Mouse control IgG serves as a negative control. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (C) ELISA analysis of gp96-scFv antibody. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (D) Immunofluorescence staining of unpermeabilized MCF-7 cells and 293T cells (as a negative control) using gp96-scFv antibody. Bar=30 μm.

2.5.2 gp96-scFv抗體的Flow cytometry檢測

用EDTA處理SK-BR-3細胞后，分別向細胞中加入1∶100 gp96 兔多克隆抗體和100 μg/mL表達純化的96-scFv抗體，其中gp96 兔多克隆抗體處理組為陽性對照組，不加96抗體為陰性對照組。孵育后分別加入FITC標記的熒光二抗，流式細胞儀結果顯示陽性對照和純化96-scFv抗體處理的都出現(xiàn)峰明顯的偏移 (圖3B)。Flow cytometry結果表明gp96-scFv抗體能夠結合細胞膜表面gp96。

2.5.3 gp96-scFv抗體的ELISA檢測

將純化的gp96蛋白10 μg依次梯減倍比稀釋包被，用1 μg/mL純化后的gp96-scFv抗體，同時加入1∶1 000 gp96兔多克隆抗體處理組為陽性對照組，經(jīng)Anti-His-HRP二抗孵育顯色后在 450 nm 讀取的吸光值 (OD450) (圖 3C)gp96-scFv抗體檢測的 gp96蛋白最低濃度為50 pg/μL。ELISA結果表明重組表達gp96-scFv抗體具有比商業(yè)化gp96兔多克隆抗體 (Enzo產(chǎn)品) 有更強的靈敏度和親和力。

2.5.4 gp96-scFv抗體的 Immunofluorescence檢測

3 討論

本研究構建了重組載體pPICZα-gp96-scFv，使用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達目的蛋白gp96-scFv抗體片段，且獲得具有較高親和力和特異性的抗 gp96蛋白的分泌型 scFv小分子抗體[21-22]。在畢赤酵母表達的目的蛋白 gp96-scFv抗體篩選體系中不僅限于傳統(tǒng)的PCR、RT-PCR及分子雜交等方法篩選，而且利用畢赤酵母其強大的分泌功能對蛋白直接篩選鑒定，本研究篩選多拷貝整合轉化子是參照了Schagger等[23]的斑點雜交方法，由于本研究中工程菌gp96-scFv基因的密碼子是畢赤酵母利用頻率最高的密碼子，同時工程菌是通過斑點雜交篩選的拷貝數(shù)較高的轉化子，因此該畢赤酵母菌具有能高效分泌表達的能力。

畢赤酵母表達目的蛋白 gp96-scFv抗體片段通過在C端連接His標簽是為了方便純化和鑒定，采用Anti-His-tag親和層析柱 (His-Trap HP) 對表達的 gp96-scFv進行純化的方法，能保持蛋白的生物活性，操作簡單、經(jīng)濟，而且可重復使用[24]。通過 Anti-His-tag親和層析柱純化目的蛋白的純度能達到 95%，在經(jīng)過截留相對分子質量為10 kDa膜進行超濾濃縮，濃縮后的目的蛋白純度效果更好。本研究中的目的蛋白在電泳SDS-PAGE圖中的條帶大小位置與預期蛋白的分子量大小接近，并通過 Western blotting鑒定了目的蛋白。并對純化的目的蛋白通過 Western blotting、Flow cytometry、Immunofluorescence等分析方法鑒定其生物活性，結果表明gp96-scFv抗體是具有較高親和力和特異性抗 gp96蛋白的 scFv小分子抗體，ELISA試驗分析發(fā)現(xiàn)表達的 gp96-scFv抗體對gp96蛋白檢測的靈敏度和親和力高于市售的商業(yè)化抗體。

利用畢赤酵母可大量和相對廉價地表達scFv抗體片段，用于 Western blotting、Immunofluorescence、ELISA和Flow cytometry檢測gp96蛋白。scFv抗體片段的最大優(yōu)點是能增強熒光激活細胞分類篩選(Fluorescenceactivated cell sorting, FACS) 和ELISA檢測等許多免疫化學應用中的靈敏性和效率[25]；其次，scFv片段一般設計某種形式的“標簽”(如組氨酸或 E-tag標簽) 可用于快速檢測和純化 gp96蛋白分子；此外，相對于傳統(tǒng)抗體，由于 scFv抗體分子小，有較強穿透能力，適合于腫瘤的檢測和靶向治療[26-27]。因此scFv片段抗體能夠廣泛地應用于臨床檢測、治療和免疫化學等

領域[28-30]。

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