邢志林，張麗杰，趙天濤,2

1重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400050 2重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045

三氯乙烯 (Trichloroethylene, TCE)、四氯乙烯 (Tetrachloroethylene, PCE) 等氯代烯烴和氯仿 (Chloroform, CF)、三氯乙烷 (Trichloroethane,TCA) 等氯代烷烴的不當(dāng)使用給人類(lèi)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌能夠降解多種氯代烴類(lèi)污染物[3-6]，甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase，MMO) 在降解過(guò)程起著關(guān)鍵作用[7]。甲烷氧化菌能夠產(chǎn)生兩種類(lèi)型的MMO：溶解甲烷單加氧酶 (Solution methane monooxygenase，sMMO) 和顆粒甲烷單加氧酶(Particulate methane monooxygenase，pMMO)[8]，由于兩種酶在底物范圍、底物親和性和對(duì)抑制劑敏感程度等方面的差異性，導(dǎo)致不同菌株催化降解氯代烴范圍和效率的不同。研究者已經(jīng)從各個(gè)方面對(duì)氯代烴的降解做了研究，包括甲烷氧化菌對(duì)不同氯代烴的降解效果[9-10]、氯代烴降解機(jī)理和其動(dòng)力學(xué)[11-12]以及氯代烴生物降解的實(shí)際應(yīng)用[13-14]等。

兼性甲烷氧化菌 (Facultative methanotrophs)與專(zhuān)一甲烷氧化菌相比有著獨(dú)特的生理學(xué)和底物選擇特性，因可以利用含碳碳鍵的有機(jī)物作為碳源和能源而更容易實(shí)現(xiàn)富集，已經(jīng)展現(xiàn)出廣闊的工程應(yīng)用前景[15-16]。兼性甲烷氧化菌能利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸和乙醇等多碳化合物[17-20]，且有些多碳化合物可被兼性甲烷氧化菌優(yōu)先利用，從而使得兼性甲烷氧化菌降解氯代烴日益成為了研究熱點(diǎn)。

對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)研，介紹甲烷氧化菌降解氯代烴的綜述性文獻(xiàn)并不多見(jiàn)。韓冰等[21]從現(xiàn)代生物技術(shù)角度介紹了甲烷氧化菌的分類(lèi)與分布、MMO的結(jié)構(gòu)與功能，其中提及了氯代烴的生物降解但未做系統(tǒng)闡述；魏素珍[22]介紹了甲烷氧化菌種類(lèi)及其在溫室氣體減排、污染物治理方面的應(yīng)用現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，涉及了共代謝的概念及氯代烴對(duì)甲烷氧化的影響；鮑倫軍等[23]描述了多種降解鹵代烴菌株的降解特性、降解途徑等；Jiang等[24]、Brigmon[25]和Sermau[26]著重介紹了甲烷氧化菌在環(huán)境工程中的應(yīng)用前景和未來(lái)的發(fā)展方向，同時(shí)也提及了兼性甲烷氧化菌降解氯代烴類(lèi)污染物以及反應(yīng)器設(shè)計(jì)的研究成果；Sullivan等[27]以甲基彎菌Methylosinus trichosporiumOB3b為模型菌株較詳細(xì)介紹了MMO的結(jié)構(gòu)、類(lèi)別及其在降解污染方面的應(yīng)用潛力。以上綜述對(duì)了解氯代烴污染物生物降解的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，但有針對(duì)性地闡述甲烷氧化菌降解氯代烴還相對(duì)不足，尤其是氯代烴降解動(dòng)力學(xué)和兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的綜述還未見(jiàn)報(bào)道。

據(jù)此，本文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究成果，并結(jié)合本課題組在甲烷氧化菌降解氯代烴方面的研究進(jìn)展，分析了純菌株和混合菌株對(duì)不同氯代烴的降解效果，考察了不同類(lèi)型甲烷單加氧酶在不同底物體系中的活性表達(dá)和催化特性，總結(jié)了模型菌株M. trichosporiumOB3b降解氯代烴的動(dòng)力學(xué)特性，簡(jiǎn)述了兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的特性及其應(yīng)用潛力，并淺析了所存在的問(wèn)題及未來(lái)的研究方向。

1 甲烷氧化菌和MMO降解氯代烴及降解動(dòng)力學(xué)研究

1.1 可降解氯代烴的甲烷氧化菌及其生物特性

1985年Wilson等[28]首次發(fā)現(xiàn)了富含甲烷氧化菌的土壤在天然氣刺激下能夠降解TCE，這打破了甲烷氧化菌只能利用甲烷的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，并在一定程度上促進(jìn)了兼性甲烷氧化菌的發(fā)現(xiàn)。隨后的十幾年，研究者利用不同甲烷氧化菌對(duì)氯代烴降解進(jìn)行了探索，主要包括混合菌和純菌株，所研究的污染物也不再局限于某一種氯代物。1986年，F(xiàn)ogel等[29]利用由泥沙中分離的混合甲烷氧化菌對(duì)TCE等6種氯代烯烴的降解進(jìn)行了研究，利用同位素14C示蹤等方法證明了甲烷氧化菌能夠?qū)⒙却鸁N轉(zhuǎn)化為CO2并能利用其合成自身生物質(zhì)。1988年，Little等[30]利用僅以甲烷、乙醇為碳源的Ⅰ型甲烷氧化菌菌株46-1降解TCE并推測(cè)了其共代謝的降解機(jī)理及其降解產(chǎn)物。同年關(guān)于甲烷氧化菌降解氯代烴的第一個(gè)專(zhuān)利及隨后利用混合菌株在反應(yīng)器中降解鹵代烴的專(zhuān)利申請(qǐng)成功[31]。

此后，Janssen等[32]也在同一年對(duì)比了混合菌株與兩種純菌甲基單胞菌Methylomonas methanicaNCIB11130和M. trichosporiumOB3b對(duì)7種氯代烴的降解。研究發(fā)現(xiàn)分離的純菌與混合菌相比并無(wú)明顯差異，說(shuō)明氯代烴的降解只是甲烷氧化菌的作用。研究者也先后對(duì)甲基孢囊菌Methylocystissp. strain M降解TCE做了研究[33-35]，然而Uchiyama等[34]發(fā)現(xiàn)純化前的混合菌株MU-81與純菌株Methylocystissp. strain M對(duì)TCE的降解有明顯的區(qū)別 (混合菌株有時(shí)能將TCE全部降解，而純菌株不能)，進(jìn)一步分離發(fā)現(xiàn)了一種非自養(yǎng)菌strain DA4，進(jìn)而證明了該菌株在甲烷氧化菌降解氯代烴過(guò)程中起著重要的作用。以上研究表明混合菌中非甲烷氧化菌的種類(lèi)繁多，而且這些菌在降解氯代烴過(guò)程中的作用有很大差異。

之前的大多數(shù)研究都停留在實(shí)驗(yàn)室層面，但環(huán)境中氯代烴污染存在污染范圍廣、面積不集中的特點(diǎn)[2,36-37]，這就對(duì)不改變環(huán)境條件、不轉(zhuǎn)移污染沉積物的原位生物修復(fù)技術(shù)提出了新的需求[25]。Semprini等[38]研究了含水土層中氯代烴的原位生物降解，發(fā)現(xiàn)灌注富含甲烷和氧氣的地下水可提高土著甲烷氧化菌活性，有效促進(jìn)氯代烴的降解。

1.2 MMO催化氯代烴降解的研究

兩種MMO如何催化氯代烴氧化及其活性的差異是長(zhǎng)期困擾研究者的問(wèn)題。研究表明，菌體生長(zhǎng)在高濃度銅離子條件下，MMO的還原型輔酶 (NADH) 會(huì)受到抑制，Ⅱ型甲烷氧化菌中的sMMO在較低濃度銅離子時(shí)才能表達(dá)[9,39]，而pMMO幾乎存在于所有的甲烷氧化菌中，但sMMO似乎比pMMO有更廣泛的特異性。大量關(guān)于sMMO的研究已經(jīng)通過(guò)M. trichosporiumOB3b展開(kāi)，純sMMO比其他混合或純菌株對(duì)TCE的降解速率高出至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，這說(shuō)明它在生物降解領(lǐng)域中有較廣泛的應(yīng)用潛力[27]。

Anderson等[9]利用表達(dá)pMMO的混合甲烷氧化菌對(duì)氯乙烯 (Vinyl chloride, VC) 等5種氯代烯烴的降解做了研究，發(fā)現(xiàn)順-1,2-二氯乙烯(cis-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE) 、TCE和1,1-二氯乙烯 (1,1-Dichloroethylene, 1,1-DCE)的降解率遠(yuǎn)小于表達(dá)sMMO的菌株，但反-1,2-二氯乙烯 (trans-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE)和VC的降解量是所報(bào)道表達(dá)sMMO細(xì)胞的20倍，這說(shuō)明同一種酶對(duì)不同底物的親和力差別較大。Oldenhuis等[7]、Tsien等[40]、Fox等[41]和Jahng等[42]利用純菌株M. trichosporiumOB3b或由其純化的sMMO對(duì)TCE在內(nèi)的氯代烴進(jìn)行降解研究，結(jié)果都顯示氯代烴的降解是sMMO的作用，該酶的降解能力遠(yuǎn)高于其他能降解TCE的酶。

盡管sMMO對(duì)許多氯代烴有高效的催化氧化作用，但sMMO在氯代烴和甲烷之間強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)性抑制和smmo基因位點(diǎn)表達(dá)易受環(huán)境影響等原因限制了該類(lèi)菌體的應(yīng)用。Jahng等[42]利用基因重組技術(shù)對(duì)重組菌株降解氯代烴做了研究，該菌株降解TCE過(guò)程不存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因而利用基因工程有望實(shí)現(xiàn)生物降解污染物的新突破。Lee等[43]發(fā)現(xiàn)表達(dá)pMMO甲烷氧化菌較sMMO菌株有更高的生長(zhǎng)速率，一些不同濃度氯代烴能影響 (促進(jìn)或抑制) 酶的活性和細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)都表明對(duì)于污染物的降解，MMO的結(jié)構(gòu)和菌體生長(zhǎng)的相對(duì)速率是重要的影響因素。

Phelps等[44]分離了一株能夠產(chǎn)生pMMO并能結(jié)構(gòu)性表達(dá)sMMO的M. trichosporiumOB3b變體菌株，其對(duì)TCE的降解速率是野生菌株的兩倍。Koh等[45]分離得到了第一個(gè)已知能表達(dá)sMMO的Ⅰ型甲烷氧化菌Methylomonas methanica68-1，該菌株能降解萘 (Naphthalene) 和TCE，其活性比相同條件下M. trichosporiumOB3b中的高，但對(duì)TCE的親和性小于M. trichosporiumOB3b (分別為(40±3) μmol/L和(126±8) μmol/L)，利用基因探針基因組示蹤和印跡雜交分析顯示兩種菌株內(nèi)的sMMO幾乎沒(méi)有同源性。以上研究表明sMMO在自然界中發(fā)展是多樣的。

sMMO催化氧化的范圍非常廣泛，包括烷烴的羥基化，烯烴、醚類(lèi)、氯代烷烴的環(huán)氧化等[46-48]，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，菌體降解范圍、菌株的生長(zhǎng)效率、生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物、酶的穩(wěn)定性及基因的表達(dá)規(guī)律等都是重要的影響因素。

1.3 氯代烴降解動(dòng)力學(xué)概述與模型菌株的降解動(dòng)力學(xué)分析

1.3.1 氯代烴降解動(dòng)力學(xué)概述

在確定了一些甲烷氧化菌能夠降解氯代烴后，研究者著手對(duì)其降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究以實(shí)現(xiàn)氯代污染物的調(diào)控和生物降解。Strand等[49]在封閉的反應(yīng)器中研究了TCE、TCA降解動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示兩種氯代烴濃度小于3 000 μg/L時(shí)，其降解均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)；通過(guò)提供底物(甲烷) 與否及改變氯代烴濃度所得結(jié)果證明該生物降解過(guò)程中底物之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制且動(dòng)力學(xué)研究存在一定的底物濃度范圍。

隨后Arvin[50]利用含有由氯代烴污染水體分離的混合甲烷氧化菌的生物膜反應(yīng)器探究了TCE等4種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)，當(dāng)氯代烴濃度在0?1.0 mg/L時(shí)，降解均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)；Broholm等[51]首次利用混合菌株提出并驗(yàn)證了底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制，以不同初始濃度的TCE(50?4 300 μg/L)和甲烷(0.53?3.2 mg/L)模擬了降解模型，該模型的建立為甲烷氧化菌降解TCE的研究及原位生物修復(fù)的工程設(shè)計(jì)提供了一定的理論指導(dǎo)。

由于在生長(zhǎng)底物和共代謝底物之間存在著競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以確定最適底物比例至關(guān)重要。Herbst[52]以TCE降解為例建立了生長(zhǎng)底物、共代謝底物和氯代物降解率之間的三維曲面 (圖1)。當(dāng)TCE濃度為7.5 mg/L時(shí)，最佳TCE的降解率處在較為狹小的區(qū)域，所以在降解研究過(guò)程中氯代烴的降解率通常較低。

圖1 TCE和底物濃度與其降解率的關(guān)系[31]Fig. 1 Dependence of the TCE degradation rate on substrate and co-metabolic substrate concentration[31].

1.3.2 菌株M. trichosporium OB3b降解氯代烴動(dòng)力學(xué)概述與分析

本文總結(jié)了模型菌株M. trichosporiumOB3b對(duì)多種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表1所示。Oldenhuis等[53]研究了M. trichosporiumOB3b對(duì)TCE等7種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明CF、t-1,2-DCE和TCE為易降解化合物，1,2-二氯乙烷 (1,2-Dichloroethane, 1,2-DCA)、TCA和1,1-DCE為難降解化合物，說(shuō)明該菌株對(duì)不同氯代烴的親和性差異較大，并認(rèn)為sMMO與CF的親和性最大。

Van Hylckama等[12]利用自動(dòng)進(jìn)樣裝置研究了TCE和CF等8種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)，并取得了與Speitel等[11]一致的結(jié)果。TCE速率常數(shù)(0.5?3.31 mg/d) 是 CF(0.2?0.4 mg/d)的 2.5?11倍，并且甲烷存在時(shí)有嚴(yán)重的酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制存在，但有的研究結(jié)果顯示 CF的降解速率高于TCE[53-55]。出現(xiàn)以上情況可能是降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)分析和微生物培養(yǎng)條件的差異所造成的。

Fox等[41]通過(guò)額外添加生物酶研究了sMMO對(duì)氯代烴降解的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果顯示TCE等氯代烴的降解速率提高了4?5個(gè)數(shù)量級(jí)，通過(guò)添加合成生物酶能夠強(qiáng)化菌株在工程上的應(yīng)用。Aziz等[56]和Fitch等[57]利用M. trichosporiumOB3b的變種菌株M. trichosporiumOB3b PP358對(duì)單一和混合氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)做了研究，該菌株對(duì)TCE等氯代烴的最大降解速率Vmax變化范圍為3.1?24.8 mg/(mgcell·d)，半飽和常數(shù)KS的變化范圍為1?10 mg/L。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有些二元氯代烴混 合 物 如 TCE (0.3?0.5 mg/L)和 c-1,2-DCE(<5 mg/L)等在降解過(guò)程無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。自然環(huán)境下的污染物是非單一性，為了使菌體實(shí)現(xiàn)工程上的應(yīng)用，有必要建立合理的單一氯代烴，二元氯代烴甚至多元氯代烴降解動(dòng)力學(xué)模型。

不同氯代烴的動(dòng)力學(xué)常數(shù)相差較大，可以看出各氯代烴的半飽和速率常數(shù)KS，最高利用率Vmax和虛擬一階速率常數(shù)ka的變化范圍分別為0.34?28.6 mg/L ， 0.45?94.2 mg/(mgcell·d) 和0.16?11.52 L/(mg·d)。由于研究條件 (溫度、培養(yǎng)條件、氯代烴濃度等) 的差異，可能會(huì)導(dǎo)致某一氯代烴降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)變化范圍較大，如CF的Vmax最大值是最小值的33.6倍，ka變化了77.7倍；TCE在濃度0.026 3?32.9 mg/L范圍內(nèi)，Vmax變化了120倍。在動(dòng)力學(xué)研究中，氯代烴的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)條件及菌株的類(lèi)型等是重要的影響因素。

對(duì)比而言M. trichosporiumOB3b通常比混合菌的降解能力強(qiáng)。同時(shí)有研究表明氯化程度也影響氯代烴的相對(duì)速率常數(shù)，且隨著氯化程度的增加菌株對(duì)氯代烷烴和氯代烯的降解能力(速率常數(shù)) 呈逐漸遞減的趨勢(shì)，二氯甲烷(Dichloromethane, DCM) 和 VC的降解速率常數(shù)在同等條件下通常較大，這與Semprini等[38]的研究結(jié)論一致。氯代烷烴的生物降解速率與氯代烯烴相比有很大的不同，氯代烯烴的最大利用率高于氯代烷烴，并且氯代烯烴的最大利用率隨氯化程度的增加呈增大趨勢(shì)，這也說(shuō)明碳碳雙鍵比單鍵更容易被降解 (圖2)。

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圖2 烴的氯化程度對(duì)一階速率常數(shù)Ka、最大利用率Vmax和半飽和常數(shù)Kc的影響Fig. 2 Impact of pseudo first-order rate constant, maximum utilization rate and half velocity constant on the extent of chlorinate. Where DCM, CF, 1,2-DCA and TCA are chloralkanes, and VC, 1,1-DCE, c-1,2-DCE, t-1,2-DCE and TCE are chloroalkenes.

2 兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的研究進(jìn)展

通過(guò)降解動(dòng)力學(xué)能夠判斷污染物的降解是哪種MMO的作用，但是污染物與生長(zhǎng)底物之間存在著復(fù)雜的酶競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。盡管甲烷氧化菌有廣泛的底物降解范圍，但是甲烷在水溶液中的微溶性使得甲烷氧化菌作為介質(zhì)的生物修復(fù)實(shí)現(xiàn)有了一定的難度。研究發(fā)現(xiàn)一些兼性甲烷氧化菌能利用多種碳源表達(dá)MMO，例如甲基細(xì)胞菌屬M(fèi)ethylocella兼性甲烷氧化菌能優(yōu)先利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸和乙醇等多碳化合物。這就使得在沒(méi)有甲烷的條件下，利用甲烷氧化菌降解污染物成為了可能，從而有望克服MMO的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.1 兼性甲烷氧化菌Methylocystis strain SB2降解氯代烴的研究現(xiàn)狀

近幾年來(lái)研究者們研究最多為變形菌綱(α-Proteobacteria) 兼 性 甲 烷 氧 化 菌Methylocystisstrain SB2，研究發(fā)現(xiàn)它能夠結(jié)構(gòu)性表達(dá)MMO，并且能夠在乙酸或乙醇為底物的培養(yǎng)基中降解多種氯代烴類(lèi)污染物[58-59]。Im等[58]利用不同底物 (甲烷和乙醇) 存在時(shí)該菌株降解氯代烴的結(jié)果表明氯代烴降解過(guò)程不影響該菌株生長(zhǎng)，該降解過(guò)程是由于pMMO的作用，pMMO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制限制了菌株的生長(zhǎng)和氯代烴的降解，且不同氯代烴的降解機(jī)理不同。

隨后Yoon等[59]首先利用PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 技術(shù)證明在乙酸鹽中pmoA的表達(dá)比在甲烷中減少了1?2個(gè)數(shù)量級(jí)，利用Methylocystisstrain SB2降解TCE等3種氯代烴的研究同樣得到了Im等的結(jié)論。Jagadevan等[10]基于Methylocystisstrain SB2降解氯代烴的研究得到了兩點(diǎn)重要的結(jié)論：1)Methylocystisstrain SB2在乙醇中生長(zhǎng)時(shí)pMMO為非必需酶，乙醇能夠作為一種選擇性生長(zhǎng)基質(zhì)促進(jìn)污染物的降解；2)Methylocystisstrain SB2能夠利用乙醇增強(qiáng)污染物的轉(zhuǎn)移和降解。

2.2 兼性甲烷氧化菌 Methylomicrobium album BG8降解氯代烴的研究現(xiàn)狀

20世紀(jì)末，Han等[60-61]、和Lontoh等[6]對(duì)甲基微菌MethylomicrobiumalbumBG8降解氯代烴做了較為系統(tǒng)的研究，通過(guò)同位素示蹤法對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，針對(duì)降解過(guò)程探究了氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)。Han等[60]根據(jù)氯代烴降解程度及對(duì)菌體的毒性作用將其分為4類(lèi)：1) 能夠被降解對(duì)菌體毒性??；2) 能夠被降解有強(qiáng)烈的毒性作用；3) 不能被降解對(duì)菌體毒性??；4) 不能被降解有強(qiáng)烈的毒性作用。Oldenhuis等[53]詳細(xì)研究了TCE對(duì)細(xì)胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的失活程度與TCE的降解量成正比，并證實(shí)細(xì)胞失活是由于降解產(chǎn)物與細(xì)胞蛋白質(zhì)共價(jià)鍵的非特異性結(jié)合。Han等[61]研究表明一氯甲烷 (Chloromethane)能夠作為該菌體碳源促進(jìn)其在甲醇中生長(zhǎng)，并得到其表觀速率常數(shù)ka和最大降解率Vmax分別為(11±3) μmol/L 和 (15±0.6) nmol/(mgcell·min)。Lontoh等[6]將莢膜甲基球菌MethylococcuscapsulatusBath中純化的pMMO用于TCE降解研究，結(jié)果表明TCE能被pMMO降解為CO2，通過(guò)乙炔致失活原理證明MethylomicrobiumalbumBG8中pMMO是氯代物氧化的活性物，并提出了TCE降解途徑：TCE首先轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化合物，而后通過(guò)自發(fā)化學(xué)反應(yīng)釋放HCl變?yōu)橐胰┧猁}，其在pMMO的作用下氧化為甲酸鹽和二氧化碳。圖3為Alvarez-Cohen等[55]提出的MMO催化氧化CF和TCE過(guò)程。

2.3 礦化垃圾中兼性甲烷氧化菌篩選與氯代烴耐受性研究

2009年，Zhao等[62]分離得到了一株兼性甲烷氧化菌Methylocystisstrain JTA1。它能提高礦化垃圾生物覆蓋層甲烷氧化能力，也對(duì)TCE、CF等氯代烴具有較高耐受性。由圖4可知，在低濃度CF (20?50 mg/L)條件下，菌株顯示了較高的甲烷氧化活性；此外，與活性細(xì)胞 (Growing cell) 相比，菌株JTA1的靜息細(xì)胞 (Resting cell)對(duì)TCE和CF有更強(qiáng)的降解活性[62]，這與M. trichosporiumOB3b在靜息細(xì)胞狀態(tài)下能夠完全降解CF[41]的結(jié)果一致。同時(shí)，利用由礦化垃圾中富集的甲烷氧化菌群研究了其靜息細(xì)胞對(duì)TCE的共代謝降解，以Monod模型為基礎(chǔ)進(jìn)行了降解動(dòng)力學(xué)推演[63]，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)TCE初始濃度為45.5 mg/L，菌體濃度Cx為1.728 g/L時(shí)，降解率為79%。降解TCE的動(dòng)力學(xué)符合Monod模型。通過(guò)擬合得到最大比消耗速率qs,max為1.51×10–4min–1、半 飽 和 常數(shù)KS為2.58 mg/L(R2=0.961)。KS小于M. trichosporiumOB3b，說(shuō)明該菌群對(duì)TCE有較強(qiáng)的親和力。以上研究有效的擴(kuò)展了兼性甲烷氧化菌的應(yīng)用領(lǐng)域，開(kāi)展基于兼性甲烷氧化菌的深入系統(tǒng)研究，有望在氯代烴生物降解的工程應(yīng)用領(lǐng)域取得新的突破。

圖3 MMO催化降解TCE和CF過(guò)程[55]Fig. 3 The process of degradation of TCE and CF by MMO[55].

圖4 Methylocystis strain JTA1對(duì)不同濃度CF的耐受性[62]Fig. 4 Chloroform tolerance of Methylocystis strain JTA1 at different concentrations of chloroform[62].

2.4 兼性甲烷氧化菌中pMMO的催化特性及其應(yīng)用潛力

pMMO和sMMO不僅在細(xì)胞中存在方式不同，而且它們對(duì)抑制劑的敏感程度也有差別，pMMO包含有更多敏感的酶[64]。與sMMO相比pMMO的底物范圍較小，降解速度較慢，所以早期的研究主要針對(duì)表達(dá)sMMO的細(xì)胞且多數(shù)只有一種甲烷氧化菌和單一污染物的簡(jiǎn)單系統(tǒng)。在復(fù)雜原位自然環(huán)境下，表達(dá)pMMO的菌株在普遍化氯乙烯類(lèi)污染物中更容易存活[43]，并且能夠氧化除環(huán)狀和芳香烴外長(zhǎng)度高達(dá)5個(gè)碳原子以上的烷烴和烯烴[27,46,65]，有研究顯示pMMO對(duì)碳的利用率比sMMO高38%[66]，這表明在利用表達(dá)pMMO的兼性甲烷氧化菌降解氯代物時(shí)有了較為廣泛的碳源，同時(shí)通過(guò)添加像乙醇類(lèi)的多碳化合物克服由于甲烷的微溶性對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響也成為了可能，這使得越來(lái)越多的研究逐漸青睞于pMMO。研究者們利用乙醇原位注入到被TCE和四氯乙烯污染的水中強(qiáng)化甲烷氧化菌對(duì)污染物的降解，并驗(yàn)證了其可行性[67-68]。Lee等[43]和Yoon等[69]利用“△模型”預(yù)測(cè)了sMMO和pMMO的表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)pMMO的甲烷氧化菌選擇的氯代烴濃度范圍超過(guò)sMMO的細(xì)胞。所以能夠利用多碳化合物的兼性甲烷氧化菌比專(zhuān)一甲烷氧化菌在降解氯代烴上有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

圖5 甲烷氧化菌群對(duì)TCE降解曲線和以Monod方程為基礎(chǔ)的降解動(dòng)力學(xué)擬合[63]Fig. 5 Degradation curve of TCE by methanotrophs and degradation kinetics of TCE based on Monod equation[63].Where Cx, rsL and CS are dry weight of the strain, average degradation rate of TCE in the interval time of measure and concentrations of TCE respectively.

兼性甲烷氧化菌降解污染物時(shí)能夠合成自身的生物質(zhì)。早期的研究中沒(méi)有對(duì)這種現(xiàn)象給出一個(gè)較為合理的解釋?zhuān)芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在甲醇為底物的培養(yǎng)基中一氯甲烷能夠刺激甲烷氧化菌的生長(zhǎng)[28]。但兼性甲烷氧化菌同化多碳化合物的途徑仍然是不清楚的，迄今為止所有已確認(rèn)的兼性甲烷氧化菌都是α-Proteobacteria，都是通過(guò)絲氨酸途徑從甲醛中對(duì)碳同化，氧化乙酸鹽過(guò)程產(chǎn)生的蘋(píng)果酸和乙醛酸鹽是絲氨酸循環(huán)的中間體[8,41]，且乙醛酸鹽是表達(dá)pMMO的細(xì)胞和純sMMO氧化TCE的初級(jí)產(chǎn)物[25]，這表明，兼性甲烷氧化菌和甲烷氧化菌利用絲氨酸循環(huán)進(jìn)行碳同化作用。

3 甲烷氧化菌降解氯代烴現(xiàn)存問(wèn)題及未來(lái)發(fā)展方向

近20年來(lái)，利用甲烷氧化菌在氯代烴類(lèi)污染物生物降解中的應(yīng)用取得了許多實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，這主要包括反應(yīng)器規(guī)模的氯代烴類(lèi)污染物生物修復(fù)[14,57,70-78]和原位實(shí)地污染物的生物移除[13,38,79-81]。生物反應(yīng)器分為基質(zhì)、菌體生長(zhǎng)及污染物的降解發(fā)生在同一空間的單級(jí)反應(yīng)器和菌體生長(zhǎng)與污染物降解發(fā)生在不同位置的多級(jí)反應(yīng)器。多級(jí)反應(yīng)器的最大優(yōu)勢(shì)是避免了生長(zhǎng)基質(zhì)和污染物之間對(duì)MMO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而提高了污染物的降解能力。原位生物修復(fù)的關(guān)鍵步驟是通過(guò)添加安全廉價(jià)的碳源、氮源等對(duì)本土甲烷氧化菌的生物刺激從而增強(qiáng)其對(duì)污染物的共代謝降解能力。該研究在土壤和廢水污染物的生物移除等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力和實(shí)用價(jià)值。

盡管甲烷氧化菌在氯代污染物的生物降解方面展示了廣泛的應(yīng)用前景，但能夠降解氯代污染物且較易控制生物活動(dòng)的甲烷氧化菌菌株的數(shù)量較少，在分子水平上對(duì)甲烷氧化菌的研究還并不完善。另外，由于專(zhuān)一營(yíng)養(yǎng)甲烷氧化菌僅能以甲烷或甲基化合物為碳源，這就使得菌體富集和擴(kuò)大培養(yǎng)手段難于在工程上應(yīng)用。而兼性甲烷氧化菌降解氯代烴過(guò)程存在著生長(zhǎng)底物和氯代烴、氯代污染物之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制[49,55-56]，污染物及共代謝產(chǎn)物的毒性也會(huì)引起菌體活性及轉(zhuǎn)化效率的降低[41,82]。

未來(lái)研究中，首先應(yīng)廣泛地利用高通量測(cè)序和宏基因組分析等先進(jìn)的基因工程手段確定兼性甲烷氧化菌在不同地域的豐度和分布。目前，兼性甲烷氧化菌的研究才剛剛起步，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)的兼性甲烷氧化菌株還不超過(guò)10個(gè)[8,83]，更多新菌的分離純化和生物特性都亟待研究。其次，應(yīng)更深入地開(kāi)展氯代烴降解的動(dòng)力學(xué)研究，包括菌體細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、氯代烴降解動(dòng)力學(xué)和共代謝底物抑制動(dòng)力學(xué)等，通過(guò)推演動(dòng)力學(xué)參數(shù)，揭示氯代烴以及其他氯代有機(jī)污染物的降解機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)新型生物反應(yīng)器和菌株的擴(kuò)培強(qiáng)化也是保證工程應(yīng)用的關(guān)鍵。這些研究不僅能夠促進(jìn)甲烷氧化菌在污染物降解領(lǐng)域的應(yīng)用，而且還能指導(dǎo)其他降解氯代烴污染物的甲基營(yíng)養(yǎng)菌研究。相關(guān)研究成果也將成為甲烷氧化菌工程應(yīng)用的重要理論和工藝基礎(chǔ)。

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