左頎，趙心清，劉海軍，胡世洋，馬中義，白鳳武

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023 2 中國(guó)石油天然氣股份有限公司 吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132021

釀酒酵母廣泛應(yīng)用于食品、釀造和燃料乙醇生產(chǎn)等領(lǐng)域，對(duì)其進(jìn)行遺傳育種研究一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。染色體整合表達(dá)可實(shí)現(xiàn)基因工程菌的穩(wěn)定遺傳。目前利用同源重組構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的釀酒酵母菌株已被廣泛研究，選取的整合位點(diǎn)包括rDNA位點(diǎn)[1]和 δ-序列位點(diǎn)[2]等多拷貝整合位點(diǎn)，以及URA3[3]、HO[4]位點(diǎn)等單拷貝整合位點(diǎn)。對(duì)β-半乳糖苷酶報(bào)告基因在釀酒酵母染色體上多個(gè)位點(diǎn)整合結(jié)果的研究表明，lacZ基因在不同位點(diǎn)整合后，酶活差異可達(dá)到8.7倍[5]，推測(cè)可能存在位置效應(yīng)，即由于染色體組蛋白甲基化等表觀遺傳學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致基因在染色體的不同位置表達(dá)水平不同[6-7]。

隨著代謝工程的不斷發(fā)展，微生物的遺傳改造常需要對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行操作，在多基因整合時(shí)受抗生素和營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記種類的限制。Cre/loxP和 FLP/FRT重組系統(tǒng)因其可去除抗生素標(biāo)記基因而被廣泛應(yīng)用于菌株的同源重組[8-9]。雖然這兩個(gè)系統(tǒng)有著非常高效的重組效率，但是重組酶識(shí)別位點(diǎn)loxP和FRT序列仍然留在基因組上，可能會(huì)引發(fā)新的同源重組[9]。因此，選擇可以徹底去除抗生素標(biāo)記基因，并且可多次循環(huán)使用的高效重組載體，對(duì)酵母菌的生物育種非常關(guān)鍵。在代謝途徑中限速步驟往往由多個(gè)基因控制，因此代謝工程操作需要對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行平衡調(diào)控。國(guó)外學(xué)者采用多基因啟動(dòng)子改組 (Multiple gene-promoter shuffling，MGPS) 方法[10]，將不同活性的啟動(dòng)子與關(guān)鍵酶基因進(jìn)行組合，從而調(diào)控多基因表達(dá)水平的平衡。但研究多基因在染色體不同位點(diǎn)的組合整合對(duì)基因表達(dá)和代謝的影響還沒有相關(guān)報(bào)道。

pAUR135載體是可以循環(huán)使用抗生素標(biāo)記的載體，該載體帶有GIN11M86基因，可在Gal10啟動(dòng)子和半乳糖誘導(dǎo)下過量表達(dá)，只保留經(jīng)過同源重組的不帶有任何外源序列的轉(zhuǎn)化子，利用該載體可對(duì)釀酒酵母進(jìn)行重復(fù)多次整合表達(dá)，但國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究目前還沒有充分開展。酵母菌代謝工程改造常需要多個(gè)基因的操作，多基因的表達(dá)需要進(jìn)行平衡匹配，才能達(dá)到較好的效果[11]。我們以木糖代謝途徑改造為例，說明了染色體組合整合表達(dá)方法構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母菌的過程，該方法也可用于其他代謝途徑基因的改造，所獲得的工程菌株不帶有任何外來基因和選擇標(biāo)記，可穩(wěn)定遺傳，為工業(yè)釀酒酵母的分子育種提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

XR和XDH基因供體為樹干畢赤酵母Scheffersomyces stipitisJCM 10742 (日本 RIKEN BioResource Center)，XK基因供體為S288c (本實(shí)驗(yàn)室保存)。工業(yè)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae6525為本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pUC18和酵母pAUR135載體購(gòu)自大連寶生物公司。釀酒酵母培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基。按照實(shí)驗(yàn)需要，加入終濃度為2.5 μg/mL金擔(dān)子素 (aureobasidin A，簡(jiǎn)稱Aba+) 進(jìn)行酵母陽(yáng)性克隆子篩選。

1.2 分子克隆所用酶及試劑盒

PCR所用 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司。DNA片段純化與回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek, Inc.。

1.3 基因克隆和載體構(gòu)建

1.3.1 染色體組合整合木糖途徑基因盒的擴(kuò)增和構(gòu)建

以S. cerevisiae6525 DNA作為模板擴(kuò)增3個(gè)基因的上下游6個(gè)同源臂序列：12 up，12 down，20 up，20 down，21 up，21 down，具體引物序列見表1。

以PsXR基因?yàn)槔龢?gòu)建整合質(zhì)粒的流程如圖1所示。根據(jù)引物兩端所連接的酶切位點(diǎn)將所有片段依次連接，形成3個(gè)基因盒。將3個(gè)基因盒分別連接在pAUR135載體骨架上，獲得表達(dá)單個(gè)基因的表達(dá)載體。

圖1 基于質(zhì)粒pAUR135的目標(biāo)基因染色體整合表達(dá)示意圖 (以PsXR構(gòu)建為例；虛線代表同源區(qū)域，實(shí)線代表交換區(qū)域)Fig. 1 Schematic diagram of pAUR135-based combinational chromosomal integration (construction of PsXR gene was presented as an example). Dashed lines represent homologous arms and solid lines represent exchanged regions.

1.3.2 載體線性化和釀酒酵母轉(zhuǎn)化

基因盒的線性化酶切位點(diǎn)分別為SpeⅠ和EcoRⅠ。利用電轉(zhuǎn)方法將3個(gè)線性化的載體依次轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，從而獲得染色體3個(gè)位點(diǎn)分別整合3個(gè)木糖代謝基因的染色體組合整合重組酵母菌株。

1.3.3 三個(gè)木糖基因的酶活測(cè)定

粗酶液的制備和酶活的檢測(cè)方法參考Eliasson等的文章[12]。每個(gè)酶活實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，以平均值作為酶活數(shù)據(jù)。

1.3.4 重組釀酒酵母乙醇發(fā)酵

重組菌株在YPD培養(yǎng)基以30 ℃、200 r/min進(jìn)行限氧發(fā)酵。初始接種的OD600為2.0。發(fā)酵培養(yǎng)基為YP培養(yǎng)基 (蛋白胨2%，酵母提取物1%) 分別加入3種混合糖濃度：20 g/L木糖和40 g/L葡萄糖；25 g/L木糖和50 g/L葡萄糖；30 g/L木糖和60 g/L葡萄糖。木糖利用率計(jì)算方法為：利用率(%)=(初始木糖濃度–剩余木糖濃度)/初始木糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因盒各個(gè)片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

所連接的同源臂20 up和20 down將PsXR定位為PRCdelta15位點(diǎn)，PsXDH定位于染色體YPRCtau3位點(diǎn)，ScXK基因定位于染色體YIRCdelta6位點(diǎn)[5]。另外PsXR和PsXDH基因分別連接PGK1啟動(dòng)子，ScXK基因連接ADH1啟動(dòng)子，3個(gè)基因全部使用CYC1終止子。

2.2 三個(gè)基因盒的構(gòu)建及菌株穩(wěn)定性

將各個(gè)組成片段通過雙酶切連接在一起，構(gòu)建完整的基因盒載體pAUR-PsXR、pAUR-PsXDH和pAUR-ScXK。然后利用內(nèi)切酶進(jìn)行載體的單酶切，鑒定片段大小后電轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母中，得到的重組木糖酵母菌傳代 180次后仍保持相應(yīng)性狀，所轉(zhuǎn)入的片段與傳代前片段完全吻合，測(cè)序結(jié)果也相同，說明利用該方法構(gòu)建的重組菌可以在工業(yè)育種生產(chǎn)中保持穩(wěn)定遺傳。

2.3 重組釀酒酵母木糖代謝途徑基因的酶活水平比較

在構(gòu)建的重組組合整合菌株中，XR在輔因子為NADPH時(shí)的酶活大于輔因子為NADH時(shí)的酶活。XDH的酶活水平僅為 XR酶活的 36%。XK的酶活水平最低，為XDH的77.8%。三個(gè)基因所用的啟動(dòng)子強(qiáng)度接近，而且 3個(gè)基因都是單拷貝整合，所以表達(dá)強(qiáng)度的差異主要來自整合位點(diǎn)的不同。與對(duì)照菌株中的3個(gè)酶活力相比，染色體組合整合菌株的XR和XDH酶活明顯提高 (表2)。

表2 重組菌株的木糖代謝關(guān)鍵酶酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities in the recombinant strains

2.4 重組釀酒酵母混合糖發(fā)酵分析

將構(gòu)建的染色體組合整合的木糖重組菌在含有葡萄糖和木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行限氧發(fā)酵。與對(duì)照重組菌株相比，染色體組合整合的重組菌株的木糖利用率提高了24.4%–35.5% (表3)。發(fā)酵結(jié)果表明，染色體組合整合表達(dá)的基因可以成功實(shí)現(xiàn)酵母菌株發(fā)酵性能的優(yōu)化 (葡萄糖數(shù)據(jù)未列出)。

表3 重組菌株的木糖利用率比較Table 3 Xylose utilization rate in the recombinant strains

3 結(jié)論與展望

利用pAUR135酵母整合表達(dá)載體，成功構(gòu)建了染色體多位點(diǎn)組合整合的酵母菌株，所獲得的菌株可穩(wěn)定遺傳。構(gòu)建基于pAUR135的整合表達(dá)載體，通過改換不同強(qiáng)度啟動(dòng)子，增加基因拷貝數(shù)，變換染色體整合位點(diǎn)等手段實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)量的組合控制，從而可實(shí)現(xiàn)多基因表達(dá)的平衡。文中提供的載體構(gòu)建方式可以方便應(yīng)用于工業(yè)釀酒酵母，是工業(yè)酵母菌育種的一種新方法。

[1]Zhang XR, Shen Y, Shi WL, et al. Ethanolic cofermentation with glucose and xylose by the recombinant industrial strainSaccharomyces cerevisiaeNAN-127 and the effect of furfural on xylitol production.Bioresour Technol, 2010, 101(18)： 7093–7099.

[2]Kato H, Matsuda F, Yamada R, et al. Cocktail δ-integration of xylose assimilation genes for efficient ethanol production from xylose inSaccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 2013, 116(3)： 333–336.

[3]Kaneko S, Tanaka T, Noda H, et al. Marker-disruptive gene integration andURA3recycling for multiple gene manipulation inSaccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83(4)： 783–789.

[4]Li Q, Zhao XQ, Chang AK, et al. Ethanol-induced yeast flocculation directed by the promoter ofTPS1encoding trehalose-6-phosphate synthase 1 for efficient ethanol production. Metab Eng, 2012, 14(1)： 1–8.

[5]Bai DM, Siewers V, Huang L, et al. Characterization of chromosomal integration sites for heterologous gene expression inSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 2009,26(10)： 545–551.

[6]Misteli T. Beyond the sequence： cellular organization of genome function. Cell, 2007, 128(4)： 787–800.

[7]Chen M, Licon K, Otsuka R, et al. Decoupling epigenetic and genetic effects through systematic analysis of gene position. Cell Rep, 2013, 3(1)： 128–137.

[8]Gueldener U, Heinisch J, Koehler GJ, et al. A second set ofloxPmarker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast. Nucleic Acids Res, 2002,30(6)： e23.

[9]Demeke MM, Dietz H, Li YY, et al. Development of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrialSaccharomyces cerevisiaestrain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering. Biotechnol Biofuels, 2013, 6：89.

[10]Lu CF, Jeffries T. Shuffling of promoters for multiple genes to optimize xylose fermentation in an engineeredSaccharomycescerevisiaestrain. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(19)： 6072–6077.

[11]Zhao XQ, Jiang RJ, Bai FW. Directed evolution of

promoter and cellular transcription machinery and its application in microbial metabolic engineering- a review.Chin J Biotech, 2009, 25(9)： 1312–1315 (in Chinese).

趙心清, 姜如嬌, 白鳳武. 啟動(dòng)子和細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制的定向進(jìn)化在微生物代謝工程中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(9)： 1312–1315.

[12]Eliasson A, Christensson C, Fredrik-Wahlbom C, et al.Anaerobic xylose fermentation by recombinantSaccharomyces cerevisiaecarryingXYL1,XYL2, andXKS1in mineral medium chemostat cultures. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(8)： 3381–3386.