張路，張潔元，李兵倉，劉爭，劉彬

1 西南大學生命科學學院，重慶 400715 2 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042 3 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715 4 重慶醫(yī)科大學生理學教研室 神經(jīng)科學研究中心，重慶 400016

周圍神缺損修復一直是人們關注的問題[1-3]。周圍神缺損修復的目的是為了實現(xiàn)缺損部位感覺和 (或) 運動機能的部分乃至完全恢復。感覺功能檢測[4]和運動功能檢測[5]是評價周圍神缺損修復效果的比較直觀的方法。目前，國內(nèi)外所報道的實驗結(jié)果大多處于組織學和電生理水平[6-8]。為了實現(xiàn)周圍神經(jīng)缺損修復的更好效果，本領域的各項探索仍具有其必要性。對軸突生長提供一個相對封閉的微環(huán)境[9]是神經(jīng)導管設計的初衷。由于考慮到物質(zhì)交換的問題，在神經(jīng)導管管壁預留一系列的孔隙也是目前普遍采用的思路，也有研究表明神經(jīng)導管管壁孔隙的存在會阻滯軸突生長的進程[9]。因此，在本研究中，采用了孔隙率低的導管。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(Poly lactic acid co glycolic acid copolymer, PLGA)[10]、細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)[11]由于具有良好的生物相容性及生物可降解性而被應用于人工神經(jīng)的研究中。ECM的主要成分為膠原和其他一些對細胞生長和粘附有促進作用的物質(zhì)[12]，在本研究中將ECM預置在PLGA神經(jīng)導管中是試圖為種子細胞的生長和粘附提供三維支架，并促進其生長。利用種子細胞修復周圍神經(jīng)缺損是一個被普遍認同的學術思路。雪旺氏細胞 (Schwann cells,SC)[13]、嗅球成鞘細胞 (Olfactory ensheathing cells, OEC)[14]、骨髓基質(zhì)細胞 (Bone marrow stromal cells, BMSC)[15]、神經(jīng)干細胞 (Neural stem cells, NSC)[16]等都被作為種子細胞。它們對促進周圍神經(jīng)缺損修復均有正效應，但都未實現(xiàn)其完全修復。影響周圍神經(jīng)缺損修復效果的因素很多，探索其他種子細胞或許能為這一問題的解決提供更多的方案。毛囊來源的神經(jīng)嵴干細胞 (Epidermal Neural Crest Stem Cell, EPI-NCSC)由于取材方便，具有多種分化潛能[17-18]，是一種具有良好應用前景的組織工程種子細胞。目前，在神經(jīng)缺損修復領域中，EPI-NCSC主要被應用于脊髓損傷的修復。研究證實，在脊髓損傷處移植EPI-NCSC，在術部局部可觀察到結(jié)構(gòu)和功能的部分恢復[19]以及神經(jīng)再生和髓鞘形成[20]。

為了探討 EPI-NCSC對周圍神經(jīng)缺損的修復作用，本研究以成年GFP、SD大鼠觸須墊為材料，原代培養(yǎng)EPI-NCSC?？疾炱潴w外性質(zhì)，并以其為種子細胞，將其等量與ECM混合后，預置入 PLGA導管中，橋接 SD大鼠坐骨神經(jīng)10 mm距離的缺失。在移植4周后，通過感覺功能檢測，神經(jīng)行為學觀測和術部組織學觀察，來探討EPI-NCSC對周圍神經(jīng)缺損的修復作用，從而為相關研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PLGA材料的制備

將PLGA (85：15, Sigma) 溶于三氯甲烷，制備成5% (W/V) 的溶液，置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，在通風櫥中揮發(fā) 48 h，以制備厚度為 25 μm 的PLGA膜。用自制模具制備內(nèi)徑為1.5 mm，壁厚0.5 mm，長度為15 mm的PLGA導管。將二者進行γ射線(2.5 Mrad)照射滅菌，在無菌條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)

EPI-NCSC 的原代培養(yǎng)按文獻[17]報道的方法進行。取成年GFP、SD大鼠 (雌性，體重200 g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供)1只，過量麻醉致死，取其觸須墊，解剖出完整毛囊，切除毛囊球部，剖開結(jié)締組織鞘，取出毛囊外根鞘，保持隆突部的完整。置于被鼠尾膠原包埋過的培養(yǎng)皿中，25 min后加入1.5 mL培養(yǎng)液(含達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM)/F12 1：1，10%FBS，2% B27，20 ng/mL bFGF)，37 ℃﹑5% CO2培養(yǎng)。3 d后半量換液，6 d后剔除毛囊，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液同前，每3天換液一次。

1.3 EPI-NCSC的鑒定

EPI-NCSC 的鑒定按文獻[17]報道的方法進行。將粘附有細胞的載玻片用PBS漂洗3次，用4%多聚甲醛常溫下固定30 min，PBS漂洗3次各5 min，用1%BSA室溫封閉30 min，傾去液體，加入小鼠抗Nestin (1∶100, Abcam, USA)和兔抗SOX10 (1∶1 000, Abcam, USA) 4 ℃孵育24 h。PBS漂洗3次，每次5 min。加入Alexa Flour 594山羊抗兔IgG (1∶50，碧云天，中國)和Cy5山羊抗小鼠IgG (1∶50，碧云天，中國)37 ℃孵育1 h。PBS漂洗3次，每次10 min。室溫晾干避光，抗熒光淬滅劑 (KPL，USA) 封片。熒光顯微鏡下觀察。

1.4 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)及其觀察

將濃度為 1×106個/mL的細胞懸液接種至PLGA膜上，在37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。同時以相同數(shù)量的細胞接種到被鼠尾膠原包被的蓋玻片上，作為對照組培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，取材用熒光顯微鏡。掃面電鏡樣品置入固定液，4 ℃冰箱固定24 h，樣品經(jīng)過梯度脫水后再噴金。

1.5 EPI-NCSC在PLGA膜表面的相對增殖率及初期附著率的噻唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色分析

用明膠預襯 96孔板后，在各孔中滴加 5%(W/V) 的PLGA三氯甲烷溶液，迅速揮發(fā)干，用γ射線照射滅菌，接種濃度為1×106個/mL的細胞懸液 (n=3)。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)4、8、12、16 h，去上清液，加入MTT工作液100 μL (含DMEM/F12+20% FBS培養(yǎng)基稀釋，終濃度為1 mg/mL) 37 ℃孵育4 h，再加入150 μL二甲基亞砜 (DMSO) 溶液，DDHZ-300臺式恒溫振蕩器37 ℃孵育30 min直至結(jié)晶產(chǎn)物完全溶解，用未經(jīng)處理的96孔板為對照組。用全波長酶標測定儀 (Thermo, USA) 在570 nm波長處檢測其OD570值。根據(jù)以下公式折算初期附著率。

初期附著率=OD570值(實驗組)/OD570(對照組)×100%

按以上相同的方法處理后，分別測定在第1、3、5和7天的OD570值，根據(jù)以下公式折算細胞相對增殖率 (Relative growth rate, RGR)。

RGR=OD570值(實驗組)/OD570值(對照組)×100%

1.6 細胞周期及DNA倍體分析

將EPI-NCSC與PLGA膜進行共培養(yǎng)，分別在第1、3、5和7天取PLGA膜，用0.25%的胰蛋白酶+0.02% EDTA消化收集細胞，DMEM/F12+20% FBS培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，75%酒精重懸固定，制成密度為1×106個/mL的單細胞懸液，4 ℃過夜。1 000 r/min離心 5 min，去除酒精固定液，加入碘化丙啶(PI，50 μg/mL) 染料 (含 RNA 酶 A 0.1 mg/mL)，4 ℃孵育25 min。用Epics XLMCL型流式細胞儀進行檢測，并根據(jù)公式計算出樣品細胞的DNA指數(shù) (DNA index，DI)，增殖指數(shù)PI，以確定PLGA材料對EPI-NCSC的細胞周期、DNA含量及倍體水平的影響。以單獨培養(yǎng)的EPI-NCSC為對照。

DI=實驗組-G1期細胞百分比/對照組-G1期細胞百分比

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)

1.7 動物實驗

1.7.1 模型的建立與分組

將體重200?220 g SD大鼠(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心)20只隨機分為2組，每組10只。實驗組為EPI-NCSC細胞懸液和ECM的混合液25 μL注射入PLGA神經(jīng)導管；對照組將等量的 ECM 和 DMEM 的混合液注射入PLGA神經(jīng)導管。用3%戊巴比妥鈉40?50 mg/kg腹腔注射麻醉，俯位固定。在右側(cè)坐骨神經(jīng)走向處切開皮膚，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，追蹤坐骨神經(jīng)至梨狀肌下緣5 mm處，切除該點以下的坐骨神經(jīng)，形成10 mm的缺損。取PLGA導管套接于神經(jīng)斷端，8-0無創(chuàng)縫線縫合神經(jīng)外膜于PLGA導管上。依次縫合肌間膜、皮膚，皮下注射青霉素10萬單位/kg。術前1 d及術后1周內(nèi)每日腹腔注射環(huán)孢霉素4 mg/kg。實驗動物分籠飼養(yǎng)。

1.7.2 組織標本的獲取和制備

在術后第4周，取實驗組大鼠。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，剖胸顯露心臟，剪開右心耳，同時左心室插管，快速灌注生理鹽水100–200 mL，待流出液體清亮后，灌注4%多聚甲醛200 mL左右。灌注結(jié)束后，取材橋接管內(nèi)再生組織10 mm，繼續(xù)后固定6 h，20%蔗糖飽和至組織沉底。冰凍縱行切片，片厚10 μm，熒光顯微鏡和進行H.E染色觀察。

1.7.3 感覺功能檢測

感覺功能檢測按文獻[4]報道的方法進行。將大鼠輕輕固定，后足浸入熱水浴中 (50 ℃)，記錄后足回縮時間，以回縮時間的長短來量化痛溫覺。術后每周均進行回縮反射檢測，先測實驗側(cè)，再測正常側(cè)作為對照。對照組方法同上。注意后足浸入熱水浴中若5 s后仍無回縮，后足立即移出熱水浴，以防止組織損傷。

1.7.4 運動功能檢測

運動功能檢測按文獻[5]報道的方法進行。自制大鼠足印行走盒，寬10 cm，長80 cm。記錄清晰的大鼠雙側(cè)后足足印。測量雙側(cè)后足的印長 (Print length, PL)，趾展 (Toe spread, TS)，中間趾展(Intermediary toe spread, ITS)，每只至少測量 5對足印，術后1周開始測量，每周測量一次。按照Bain-Mackinnon-Hunter坐骨神經(jīng)功能指數(shù)公式計算出SFI值。

SFI= –38.3×PLF+109.5×TSF+13.3×ITF–8.8

其 中 PLF=(EPL–NPL)/NPL， TSF=(ETS–NTS)/NTS，ITF=(EIT–NIT)/NIT。E代表實驗側(cè)(Experimental side)，N 代表正常側(cè) (Normal side)。正常大鼠的SFI值約為0，坐骨神經(jīng)完全損傷后SFI值約為–100。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)及鑒定

GFP大鼠毛囊在體外培養(yǎng)3 d時，EPI-NCSC從隆突處爬出 (圖1A)。EPI-NCSC細胞經(jīng)第一次傳代后，在熒光顯微鏡下被激發(fā)出綠色熒光(圖 1B)。行 Nestin (圖 1C) 和 SOX10 (圖 1D) 熒光免疫組化鑒定,細胞呈陽性，胞漿被激發(fā)出藍色和紅色熒光，細胞核陰性。由此可以確定原代培養(yǎng)的細胞為EPI-NCSC。

2.2 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)及其觀察

圖1 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)及鑒定Fig. 1 Culture and immunofluorescence staining for EPI-NCSC. (A) Hair follicle and EPI-NCSC on the 3th day. (B) Observed with fluophot. (C)Immunofluorescence staining of Nestin. (D)Immunofluorescence staining of SOX10. (E)Immunofluorescence staining of SOX10 and Nestin.

圖2 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)觀察Fig. 2 EPI-NCSC co-cultured with materials. (A)EPI-NCSC on a coverslip (fluophot). (B) EPI-NCSC on a PLGA membrane (fluophot). (C) EPI-NCSC on a coverslip (SEM). (D) EPI-NCSC on a PLGA membrane(SEM).

EPI-NCSC在分別與被鼠尾膠原包被的蓋玻片 (圖2 A,C) 和PLGA膜 (圖2 B,D) 共培養(yǎng)3 d后，在熒光顯微鏡 (圖2 A,B) 和掃描電子顯微鏡 (圖2 C,D) 下均觀察到了細胞。在蓋破片上的細胞形態(tài)大部分呈梭形，有的突起多，細胞之間靠分支相連；在 PLGA膜上細胞形態(tài)呈長梭形，有突起，細胞聚集生長。

2.3 EPI-NCSC細胞在PLGA膜表面的相對增殖率及初期附著率的MTT分析

EPI-NCSC在接種PLGA膜上4 h到16 h，OD值呈增加趨勢，略低于對照組，但兩者在統(tǒng)計學上無顯著性差異 (P＞0.01) (圖 3)。EPI-NCSC在PLGA膜上的初期粘附率為89.7%。

EPI-NCSC接種于 PLGA膜上 1?7 d，OD值與對照組均呈遞增態(tài)勢，但兩者在統(tǒng)計學上無顯著性差異 (P＞0.01) (圖4)。EPI-NCSC在1、3、5、7 d的細胞相對增殖率分別為 89.3%、87.6%、85.6%和96.6%。

2.4 細胞周期及DNA倍體分析

PLGA組的G0/G1期 (靜止期/DNA合成前期) 細胞百分比不斷減少，S期 (DNA合成期)細胞百分比不斷增加，與對照組 EPI-NCSC的細胞周期變化趨勢相同，PLGA組的G2/M期細胞百分比與正常的細胞百分比變化趨勢也相同,兩者無顯著性差異(*P> 0.01) (圖5)，說明PLGA并不影響EPI-NCSC的細胞周期變化。

圖3 EPI-NCSC在PLGA膜上的粘附試驗 (MTT)Fig. 3 Adhesion of EPI-NCSC on a PLGA membrane(MTT).

圖4 EPI-NCSC在PLGA膜上的增殖試驗 (MTT)Fig. 4 Development of EPI-NCSC on a PLGA membrane (MTT).

PLGA組在1?7 d DNA指數(shù) (DI值) 均在1.0±0.1范圍內(nèi) (表1)，為正常DNA二倍體細胞，證實PLGA材料對EPI-NCSC無致癌性，二者聯(lián)合應用對機體無害。

PLGA組在1?7 d增殖指數(shù) (PI值) 與對照組增值變化相同，都有增加趨勢。兩者無顯著性差異 (P＞0.01) (圖 6)。PLGA 對 EPI-NCSC的增值變化影響不大。

2.5 術部的形態(tài)學觀察

在移植4周后，PLGA導管仍然保持著管狀形態(tài) (圖7A)。移植體內(nèi)被細胞充滿，多數(shù)細胞顯示出綠色熒光 (圖7E, E′)。與正常坐骨神經(jīng)組織 (圖7B, B′) 相比，移植體內(nèi)的細胞排列無順序，細胞之間比較緊密，細胞形態(tài)不規(guī)則。在ECM/DMEM 組(對照)中 (圖 7C, C′)，移植體組織結(jié)構(gòu)松散，組織間有泡狀空隙，細胞數(shù)量比細胞移植組明顯減少。

圖5 EPI-NCSC的細胞周期分析Fig. 5 Cell cycle of EPI-NCSC. (A) Percentage of G0/G1 phase cells. (B) Percentage of G2/M phase cells.(C) Percentage of S phase cells. *Values are not significantly different at P>0.01 (t-test). **Values are not significantly different at P>0.05 (t-test).

表1 不同時間點的DI值Table 1 DI values of time

圖6 不同時間點PI值變化Fig. 6 PI values of time.

圖7 移植4周后術部神經(jīng)的形態(tài)Fig. 7 Defected sciatic nerve after four weeks of transplant. (A) Area of transplant. (B) Cross section of normal sciatic nerve (H.E). (B') Longitudinally cut section of normal sciatic nerve (H.E). (C) Cross section of control group (H.E) . (C') Longitudinally cut section ofcontrol group (H.E). (D) Cross section of experiment group (H.E). (D') Longitudinally cut section of experiment group (H.E). (E) Longitudinally cut section of experiment group (fluophot). (E') Cross section of experiment group (fluophot).

2.6 感覺功能檢測

正常大鼠后足回縮時間在1.46?1.49 s之間。術后 1周各組實驗側(cè)的后足回縮時間較正常側(cè)延長2.5 s左右，與正常側(cè)回縮時間有顯著性差異 (P＜0.01)。術后3 周實驗組出現(xiàn)感覺功能的改善，對照組無明顯的改善。在 4周時，實驗組感覺功能繼續(xù)好轉(zhuǎn)，回縮時間恢復至(2.93±0.02) s，而對照組 (在PLGA導管中，以等量的ECM/DMEM代替EPI-NCSC和ECM的混合物) 感覺功能仍未改善 (表2)。

2.7 運動功能檢測

正常大鼠的SFI值為0。術后1周，由于后足足印長度急劇增加，趾展、中間趾展的大幅減小，各組SFI值均降至–97~–100之間。術后3周實驗組SFI值有顯著提高，對照組SFI值無明顯提高。在4周時，實驗組SFI值繼續(xù)增加，而對照組提高不明顯 (表3) (P＜0.05)。

表2 術后各組回縮反射時間Table 2 Time of leg contraction (s,±s, n=5)

表2 術后各組回縮反射時間Table 2 Time of leg contraction (s,±s, n=5)

*Values are significantly different at P<0.01 (t-test).

表3 術后不同時間點各組SFI值Table 3 SFI value of time (±s, n=5)

表3 術后不同時間點各組SFI值Table 3 SFI value of time (±s, n=5)

*Values are significantly different at P<0.05 (t-test).

3 討論

本實驗所培養(yǎng)的細胞符合大鼠EPI-NCSC[17]的鑒定特征。通過與 PLGA膜的共培養(yǎng)，EPI-NCSC在 PLGA膜上的初期粘附率為89.7%。EPI-NCSC在1、3、5、7 d時，在PLGA上的細胞相對增殖率分別為 89.3%、87.6%、85.6%和 96.6%。這些都說明 PLGA材料對EPI-NCSC具有很好的親和性。通過細胞周期及DNA倍體分析，結(jié)果顯示EPI-NCSC在與PLGA的共培養(yǎng)中，其細胞周期的變化趨勢與單獨培養(yǎng)的 EPI-NCSC相同。說明 PLGA并不影響EPI-NCSC的細胞周期變化。

在移植4周后，PLGA導管仍然保持著管狀形態(tài)，這是由 PLGA在動物體內(nèi)的降解性質(zhì)所決定的。移植體內(nèi)被細胞充滿，多數(shù)細胞顯示出綠色熒光。這說明神經(jīng)斷端的細胞和外源性添加的 EPI-NCSC共同參與了神經(jīng)缺損修復。這些新生組織細胞組成，可能包含了雪旺氏細胞[21]、成纖維細胞和早期神經(jīng)元或成熟神經(jīng)元，同時也可能包含了處于不同分化階段的EPI-NCSC。將EPI-NCSC移植入嚴重損傷的神經(jīng)處，該細胞大部分轉(zhuǎn)化為雪旺氏細胞，雪旺氏細胞為神經(jīng)元的再生提供營養(yǎng)支持。與正常坐骨神經(jīng)組織相比，移植體內(nèi)的細胞排列較為松散，這說明，需要為實驗動物提供更久的時間，以達到更好的修復效果。在 ECM/DMEM對照組中，神經(jīng)組織沒有再生，移植體內(nèi)成空泡狀，細胞數(shù)量明顯少于細胞移植組。這說明，外源性添加 EPI-NCSC對于神經(jīng)缺損的修復是必要的。

在感覺功能檢測試驗中，大鼠后足回縮的動作，部分可能是由隱神經(jīng)的感覺作用以及腿部皮膚、肌肉和韌帶的彈性回縮。但是，在本實驗中，術后各組回縮反射時間隨時間變化呈現(xiàn)出一個縮短的趨勢，這說明坐骨神經(jīng)的功能得到了部分恢復。

在運動功能檢測試驗中, 術后各組SFI值隨時間變化體現(xiàn)出一個提高的趨勢，這也說明坐骨神經(jīng)的功能得到了部分恢復。但是，為了更明確地闡明其修復作用，還有很多工作需要開展。比如，需要進一步地闡明在移植部位 (圖7E, E′)，坐骨神經(jīng)缺損在修復過程中，新生組織的細胞組成及其來源，以及新增細胞與軸突的間的排列方式等。

4 結(jié)論

PLGA材料對EPI-NCSC具有很好的生物相容性。外源性添加 EPI-NCSC對于神經(jīng)缺損的修復是必要的。在4周的時間內(nèi)，EPI-NCSC使10 mm缺失的坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能得到了部分恢復。

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