李國輝，王鵬，李芒芒，徐五，胡朝陽，姚勤

江蘇大學生命科學研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng) (BEVS) 是四大真核表達系統(tǒng)之一，與其他表達系統(tǒng)相比，BEVS具有一些獨特的優(yōu)越性，具體表現在：第一，外源基因在多角體強啟動子的控制下，其表達產量較高；第二，BEVS具有能同時表達多個基因以及大片段DNA的能力；第三，表達產物具有正確的折疊以及翻譯后加工、修飾等特性；第四，由于桿狀病毒不感染脊椎動物，是一個相對安全的生物表達系統(tǒng)[1-4]。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)或家蠶核型多角體病毒(BmNPV) 是BEVS中常利用的桿狀病毒表達載體，所表達出來的蛋白產物與其對應的天然產物具有相近的生物活性、抗原性和免疫原性，是一種非常理想的外源蛋白表達系統(tǒng)[5-6]。自1985年利用該系統(tǒng)首次成功表達人干擾素-β(IFN-β) 以來，現已包括白介素 1-3 (IL-1、IL-2、IL-3) 以及病毒來源的蛋白都獲得表達，并對其進行了后續(xù)的功能研究，進而為蛋白藥物以及高效價基因工程疫苗的研發(fā)和生產奠定了基礎[7-10]。

BEVS在生產實踐中已有近30年的應用歷程，如今，BEVS已被廣泛應用于外源蛋白的表達、疫苗生產、生物殺蟲劑和基因治療等研究領域中[11-14]。利用 BEVS表達外源蛋白，需要將重組桿粒DNA轉染昆蟲細胞制備具有感染性的重組病毒粒子[15-17]，因此有效地判斷轉染的細胞中是否成功地產生了重組病毒粒子，是后續(xù)實驗中靶蛋白獲得表達的一個重要前提。通過比較轉染前后的細胞形態(tài)變化，經驗豐富的研究人員能夠判定感染性病毒粒子產生的情況，而初學者難免不會作出誤判，不利于重組病毒粒子的鑒定及后續(xù)研究的進行。為此，本研究在 BEVS中引入綠色熒光基因，構建了BmNPV來源的極早期基因ie1啟動子控制egfp基因表達盒和多角體啟動子控制外源基因雙表達載體，通過轉座將這兩個啟動子控制下的雙表達盒插入到家蠶穿梭載體Bm-Bacmid中，創(chuàng)建一個整合型表達egfp和靶基因的重組Bm-Bacmid，進而利用可視化的綠色熒光信號，來快速判定重組桿粒 DNA在轉染后的家蠶BmN細胞中病毒粒子的產生。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和試劑

用于質?？寺〉拇竽c埃希菌Escherichia coliTG1及含有家蠶穿梭質粒 Bm-Bacmid的DH10B宿主菌在LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，含有pFastBacI質粒的大腸桿菌 DH5α以及含有pFastHTB質粒的大腸桿菌DH5α保存于本實驗室。家蠶BmN細胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的TC-100昆蟲細胞培養(yǎng)基中，在27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的家蠶BmN細胞用于轉染及病毒感染實驗。pMD18T-egfp和pMD18T-ns1載體由本實驗室保存?？敲顾亍北迩嗝顾睾退沫h(huán)素購自Sigma公司。SnaBⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、NheⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Taq酶和pMD18-T載體購自寶生物工程 (大連) 有限公司。IPTG 和 X-gal購自上海朝瑞生物公司。引物合成和序列測定由上海生工生物工程公司完成。

1.2 重組質粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-Ppolh

的構建

為擴增桿狀病毒BmNPV基因組中的極早期基因ie1啟動子，通過Primer Premier 5.0軟件設計兩條特異性引物ie1-F和ie1-R(表1)，通過PCR從BmNPV基因組中擴增 560 bp長的DNA片段，對擴增后的 DNA片段分別進行SnaBⅠ和BamHⅠ單酶切，將酶切后的目的DNA進行切膠純化，并將純化后的 DNA克隆到pFastHTB載體上產生重組質粒 pFastHTB-Pie1；為擴增egfp基因序列全長，通過Primer Premier 5.0軟件設計兩條特異性引物egfp-F和egfp-R，通過PCR擴增得到720 bp的egfp基因全長序列，對擴增得到的目的 D N A片段進行BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切，對雙酶切后的產物進行切膠回收，并將回收后的產物與載體pFastHTBPie1進行連接，結果產生重組質粒 pFastHTBPie1-egfp。

1.3 重組質粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-

Ppolh-ns1-sv40的構建

1.4 重組桿粒Bm-Bacmid的構建

1.5 重組病毒粒子的制備

將經PCR鑒定正確的重組克隆接種在含有3 種抗生素 K+G+T+(50 μg/mL 卡那霉 素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、225–320 r/min的條件下培養(yǎng)48 h后；取1.5 mL培養(yǎng)的菌液離心，對離心后的菌體抽提重組桿粒。在脂質體 Cellfectin?Ⅱ(Cat.no.10362-100)的介導下，將上述抽提的重組桿粒DNA轉染BmN細胞，通過熒光顯微鏡對轉染后的細胞進行熒光觀察；為進一步證實產生的重組病毒粒子是否具有感染性，收集轉染后的細胞培養(yǎng)上清，將其與BmN細胞孵育1 h后，棄上清，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡對感染后的細胞在不同時間點進行連續(xù)觀察。

1.6 Western blotting分析

對重組桿粒DNA轉染后的BmN細胞進行熒光顯微觀察，收集能觀察到綠色熒光的轉染孔中的細胞培養(yǎng)上清，將收集的轉染上清感染BmN細胞，進而收集感染4 d后的BmN細胞，對感染后的細胞總蛋白進行Western blotting分析，由于表達的NS1蛋白N端融合有6×His 的序列標簽，用抗6×His Tag單克隆抗體 (Earthox)為一抗，堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司) 為二抗，顯色底物為 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒 (海門碧云天生物技術有限公司)。

2 結果

2.1 重組質粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-Ppolh的構建策略

2.2 重組質粒 pFastBacI-

2.3 重組桿粒 Bm-Bacmid-

2.4 重組桿粒DNA轉染BmN細胞后的熒光顯微觀察

通過轉座將ie1早期啟動子控制下的egfp表達盒引入到家蠶 Bm-Bacmid中，重組桿粒DNA在脂質體Cellfectin的介導下進入BmN細胞中，對轉染后的BmN細胞不同的時間點連續(xù)進行熒光顯微觀察，鑒定重組 Bm-Bacmid在BmN細胞中綠色熒光蛋白的表達情況。熒光顯微結果表明：轉染24 h后，在BmN細胞中能看到零星的綠色熒光信號，隨著時間的延長，綠色熒光信號越來越多 (圖4 A)；為驗證轉染上清中是否產生了重組芽生型病毒粒子以及是否具有感染性，收集轉染96 h后的細胞培養(yǎng)上清，將其與新培養(yǎng)的BmN細胞進行孵育，24 h后，熒光顯微結果表明：在轉染上清孵育的BmN細胞中能觀察到綠色熒光，隨著時間的延長，熒光信號越來越多；96 h后，整個視野中都充滿了綠色熒光信號 (圖4 B)，這些結果表明：轉染后的細胞上清中已產生了具有感染性的重組病毒粒子；由此可見，可視化綠色熒光信號的介入有助于我們快速判定重組病毒粒子的產生，以及重組病毒粒子是否能夠啟動下一輪感染。

2.5 NS1蛋白的表達和鑒定

圖5 NS1蛋白的Western blotting分析Fig. 5 Western blotting analysis of target protein NS1 expressed in BmN cells. M： standard protein marker; 1：negative control; 2： sample of NS1 protein.

3 討論

桿狀病毒是一種非人源化的病毒，只特異性地感染無脊椎動物，現已被遺傳改造為真核表達載體，實踐證明改造后的桿狀病毒是一種非常有效的蛋白表達載體，已廣泛用于外源基因的表達并成功表達上千種功能蛋白[7,22-24]；除此之外，桿狀病毒囊膜上還可展示異源蛋白，以及通過 BEVS在昆蟲細胞內表達異源病毒的一些結構蛋白，使其在胞內組裝成病毒樣顆粒，可用來制備高效價的病毒疫苗；利用桿狀病毒在哺乳細胞內不能增殖的特性，將其改造為基因治療載體，在靶向治療人類疾病方面擁有巨大的應用前景[1]。

利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達外源基因，從重組病毒感染的細胞中純化表達的靶蛋白，在體外對純化后的靶蛋白進行活性分析，這是目前對未知基因功能研究常用的一種方法。然而，桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)也有許多不足之處有待于進一步改進，尤為突出的是重組病毒感染細胞后會導致細胞裂解，顯著降低靶蛋白的表達產量，從而增加了外源蛋白表達所需的成本和時間[25]；另外，連續(xù)多次感染昆蟲細胞后產生的重組病毒容易發(fā)生目的基因丟失，致使靶蛋白表達產量降低甚至不表達[26]；其次，還有一些具有特殊理化性質的蛋白，比如豬瘟病毒 ( CSFV) E2蛋白[27]，其在昆蟲細胞中的表達量偏低或者根本不表達，而 Western blotting往往檢測不到這一類蛋白的表達，由此讓我們對表達流程中的系列步驟產生質疑，需要對實驗過程中產生的中間產物逐一進行驗證，尤其需要對轉染后的昆蟲細胞中是否產生了重組病毒粒子進行鑒定，而反復通過RT-PCR和Western blotting來對實驗中的每個步驟進行驗證，耗時、耗力、且浪費試劑，因此快速、有效地鑒定轉染后的昆蟲細胞中已產生具有感染性的重組病毒粒子，不僅與靶基因能否在BEVS中順利表達直接相關，同時也是用來判定外源基因在 BEVS中表達或不表達的一個重要參數。

本文實驗結果表明：通過構建整合性表達egfp的重組 Bm-Bacmid，是一種可行、有效地且能夠快速判定轉染后的細胞中是否產生了感染性的重組病毒粒子，利用該整合型表達載體成功地表達了家蠶二分濃核病毒(BmBDV)非結構蛋白 NS1。NS1蛋白的快速表達，為進一步揭示NS1蛋白的磷酸化表達模式與功能機制之間的相互關系以及為表達其他外源基因奠定了堅實的科學基礎；同時也極大地促進和優(yōu)化了桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)在外源蛋白表達中的應用。

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