劉麗娜+殷云勤+張兆美+席玉

[摘要] 目的 探討AGR2和Lgr5在人CRC中表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，評價(jià)二者聯(lián)合檢測對CRC診斷的意義。 方法 采用免疫組化SABC法檢測70例CRC組織和20例癌旁正常組織中AGR2和Lgr5的表達(dá)情況。結(jié)果 ①CRC組織中AGR2陽性表達(dá)率較癌旁正常組織顯著性增高（68.57%、25.00%，P﹤0.01）。在CRC組織中，AGR2的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)（P﹤0.05）。②CRC組織中Lgr5陽性表達(dá)率較癌旁正常組織顯著性增高（74.29%、40.00%，P﹤0.01）。在CRC組織中，Lgr5的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性（P﹤0.05）。③聯(lián)合檢測AGR2、Lgr5曲線下面積與單獨(dú)檢測比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均﹤0.05）。結(jié)論 AGR2、Lgr5在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，兩者聯(lián)合檢測有助于對CRC患者腫瘤進(jìn)展的判斷，為CRC患者的分子診斷和治療提供了理論支持。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸腫瘤； AGR2； Lgr5； 免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）14-0008-04

近年來我國結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病和死亡呈逐年上升趨勢[1]，發(fā)病率和死亡率明顯高于世界平均水平[2]。目前從分子水平上探索CRC的發(fā)生機(jī)制、侵襲轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)已成為CRC研究的熱點(diǎn)。人前梯度蛋白AGR2（Anterior Gradient-2，Agr2）作為人類早期階段前后位分化的相關(guān)蛋白，是來源于非洲爪蟾蛋白XAG2的人型同系物[3]。眾多研究表明，AGR2與多種腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，關(guān)于AGR2對腫瘤的調(diào)控作用和機(jī)制， 已成為目前腫瘤研究領(lǐng)域的又一重要熱點(diǎn)[4]。富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5， Lgr5）作為Wnt通路的目標(biāo)基因，結(jié)合R-脊椎蛋白能夠使Wnt/β-catenin信號增強(qiáng)， 從而參與了結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生[5]。最近研究還發(fā)現(xiàn)[6，7]，Lgr5+干細(xì)胞可能是CRC起始細(xì)胞，并與CRC的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究采用免疫組化方法檢測AGR2、Lgr5在CRC及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，旨在探討AGR2、Lgr5在CRC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，初步評價(jià)二者聯(lián)合檢測對CRC臨床病理診斷的意義，為CRC的分子診斷和治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

收集山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院病理科2010年1月～2011年12月間CRC患者的石蠟標(biāo)本70例，同時(shí)對標(biāo)本的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，其中男28例， 女42例， 年齡29～82歲，平均年齡63.7歲；病理分型中高分化17例， 中分化38例，低分化15例；浸潤未及漿膜29例，浸潤至漿膜層和漿膜層外41例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例， 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。癌旁組織20例，取自上述CRC標(biāo)本腫塊邊緣距腫塊5 cm或以上正常結(jié)直腸黏膜組織石蠟標(biāo)本，均經(jīng)病理證實(shí)無癌浸潤，其中男8例，女12例，年齡31～59歲，平均年齡45.7歲。所有CRC患者術(shù)前3個(gè)月均未行化療或放療檢查，且除外其他消化道疾病和其他器官腫瘤病史。

1.2 試劑

兔抗人AGR2蛋白多克隆抗體購自美國的Proteintech Group Inc公司，兔抗人Lgr5單克隆抗體為Dako公司產(chǎn)品，SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自武漢博士德生物公司。

1.3 方法

采用免疫組化SABC法。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽高溫高壓修復(fù)抗原，一抗AGR2多克隆兔抗，稀釋比例為1∶300，37℃孵育1h；一抗Lgr5單克隆抗體，稀釋比例為1∶400，4℃過夜孵育。使用DAB顯色，應(yīng)用蘇木精對比染色，最后顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

AGR2蛋白染色以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。染色評分標(biāo)準(zhǔn)按照著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)綜合計(jì)算，并參照許良中和楊文濤的方法判定結(jié)果[8]。每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無色、淺黃色、黃色、棕黃色分別計(jì)為0、1、2、3分；陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、51%～80%為3分、≥81%為4分；以上兩項(xiàng)的乘積0～3分為陰性，4分及以上均為陽性。（4～5分為輕度陽性，6～9分為中度陽性，10分以上為強(qiáng)陽性）。Lgr5蛋白染色以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性。在每張切片中隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×200），其中每視野以200個(gè)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)<10%的判為染色陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用相對數(shù)表示，樣本率之間比較用χ2 檢驗(yàn)或 Fishers精確概率法。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AGR2蛋白免疫組化檢測結(jié)果

2.1.1 AGR2蛋白的表達(dá)和分布 AGR2染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色。AGR2在癌旁正常組織細(xì)胞中無表達(dá)或弱陽性表達(dá)，見封三圖1 A；在CRC腫瘤細(xì)胞呈陽性（見封三圖1B）或強(qiáng)陽性表達(dá)（見封三圖1 C、D），染色分布呈異質(zhì)性，表現(xiàn)為片狀、灶狀或散在分布，腫瘤細(xì)胞間質(zhì)無著色。AGR2在CRC組織的陽性表達(dá)率（48/70，68.57%）明顯高于在癌旁正常組織的陽性表達(dá)率（5/20，25.00%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.198，P﹤0.01），見表1、封三圖2。

2.1.2 不同臨床病理特征的CRC組織中AGR2蛋白表達(dá)比較 在CRC組織中，AGR2蛋白的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、浸潤深度無相關(guān)性（P>0.05），與癌組織的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P﹤0.05）；AGR2在高分化、中分化和低分化組織中的陽性表達(dá)率分別為41.18%（7/17）、73.68%（28/38）和86.67%（13/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（26/31，83.87%）的AGR2蛋白表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（22/39，56.41%）的組別，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。見表2。

2.2 Lgr5蛋白免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1 Lgr5蛋白的表達(dá)和分布 Lgr5染色大多定位于細(xì)胞質(zhì)中，部分可細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜同時(shí)著色，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。Lgr5在癌旁正常組織中無表達(dá)或弱表達(dá)，見封三圖3A，在CRC組織中則呈高表達(dá)，見封三圖3B，染色分布呈局灶、簇狀分布或呈彌漫片狀分布。Lgr5在CRC組織的陽性表達(dá)率（52/70， 74.29%）明顯高于在癌旁正常組織的陽性表達(dá)率（8/20，40.00%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.229，P=0.004），見表3、封三圖4。

2.2.2 不同臨床病理特征的CRC組織中Lgr5蛋白表達(dá)的比較 在CRC組織中，Lgr5蛋白的陽性表達(dá)與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)（P>0.05），與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P﹤0.05）；腫瘤低分化（12/15，80.00%）、浸及漿膜及漿膜外（35/41，85.37%）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（28/31，90.32%）的Lgr5蛋白表達(dá)分別顯著高于高分化（8/17，47.06%）、未及漿膜（17/29，58.62%）、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（24/39，61.54%），且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。見表2。

2.3 AGR2、Lgr5對CRC診斷的評價(jià)

見表4、封三圖5。①AGR2診斷CRC的曲線下面積（AUC）為0.718（95%CI 0.613～0.808），其靈敏度為68.57%，特異度為75.00%；②Lgr5的AUC為0.671（95%CI 0.564～0.767），靈敏度為74.29%，特異度為60.00%；③聯(lián)合檢測AGR2和Lgr5，AUC為0.811（95%CI 0.714～0.886），靈敏度為77.14%，特異度為95.00%；④使用Medcalc軟件進(jìn)行AUC比較，單獨(dú)檢測與聯(lián)合檢測AGR2、Lgr5，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；而AGR2、Lgr5的AUC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此，聯(lián)合檢測組織中AGR2、Lgr5的陽性率可明顯提高CRC診斷的靈敏度及特異度。

3 討論

3.1 AGR2與Lgr5概況

AGR2源自非洲爪蟾蛋白XAG2（Xenopus anterior gradient 2）人型同系物，與爪蛙外胚層的發(fā)育過程及早期階段前后位的分化有關(guān)[9]。AGR2 mRNA在人前列腺、乳腺、結(jié)腸及胰腺組織的分泌上皮細(xì)胞表達(dá)，其蛋白主要定位在分泌上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是一種分泌性蛋白[10]。本研究觀察到AGR2表達(dá)主要位于結(jié)直腸組織的腺上皮細(xì)胞，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，且以腺腔面表達(dá)為主，這也證實(shí)了AGR2蛋白具有分泌特性。

Lgr5是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新的7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族成員[11]，含7次a螺旋跨膜區(qū)和17個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列，其中N-和C-末端尾部富含半胱氨酸序列， 可在胃腸道、毛囊等多種組織中表達(dá)。最近研究還發(fā)現(xiàn)，Lgr5是腸道干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記物，并可在CRC中出現(xiàn)過表達(dá)，因此猜測它可能是一種CRC的干細(xì)胞標(biāo)記物[12]。

3.2 AGR2蛋白與CRC

本研究結(jié)果顯示，AGR2蛋白在CRC組織的陽性表達(dá)率（48/70，68.57%）較癌旁正常組織的陽性表達(dá)率（5/20，25.00%）明顯增加。通過分析CRC組織中AGR2表達(dá)與患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，AGR2表達(dá)與腫瘤組織的分化程度密切相關(guān)，低分化CRC組織AGR2陽性率較高分化CRC顯著增高，表明腫瘤分化程度越低，AGR2表達(dá)量越高。研究還發(fā)現(xiàn)，AGR2表達(dá)與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，AGR2在31例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性表達(dá)率（83.87%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率（56.41%）。上述結(jié)果與Valladares等[7]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)部分CRC腫瘤組織中AGR2的mRNA水平上調(diào)，同時(shí)高轉(zhuǎn)移性腫瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，說明AGR2是一種腫瘤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白。Kim等[13]也進(jìn)一步證實(shí)，AGR2基因在黏液性CRC中cDNA含量較非黏液性CRC上調(diào)3.3倍，AGR2的過表達(dá)與患者預(yù)后差明顯相關(guān)。上述結(jié)果均提示，AGR2在CRC中高表達(dá)，其異常表達(dá)可能在CRC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用，可作為一種有潛在價(jià)值的腫瘤分子標(biāo)志物。但這種AGR2蛋白在CRC組織中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)AGR2蛋白表達(dá)與年齡、性別、浸潤深度及TNM分期均無顯著相關(guān)性（均P﹥0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。

3.3 Lgr5與CRC

目前研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5的過表達(dá)可能參與CRC的發(fā)生，但是否參與CRC進(jìn)展及腫瘤轉(zhuǎn)移尚存爭議。Ziskin等[14]曾對891例CRC組織中Lgr5進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lgr5的表達(dá)與腫瘤的侵襲性及預(yù)后無關(guān)。而Walker等[15]卻提出Lgr5表達(dá)下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的能力反而增強(qiáng)，所以認(rèn)為Lgr5表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞黏附力增強(qiáng)和致瘤性降低有關(guān)。本研究采用免疫組化方法對CRC組織和正常組織進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CRC組織中Lgr5蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織（χ2=8.229，P=0.004），結(jié)果還顯示，Lgr5蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P﹤0.05），而與年齡、性別無明顯相關(guān)性（均P﹥0.05）。本研究結(jié)果與Takahashi[16]及Wu等[17]結(jié)果相一致，均提示Lgr5表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了CRC惡性轉(zhuǎn)化、侵襲及轉(zhuǎn)移，對于CRC進(jìn)展發(fā)揮了重要作用，因此Lgr5可作為一個(gè)判斷CRC患者腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)，但對于Lgr5參與CRC發(fā)展的機(jī)制尚不明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。