楊晨+楊林花+張耀方+張睿娟+葛曉燕+任方剛

[摘要] 目的 探討CD25與急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）的常見免疫表型標(biāo)記間的相關(guān)性，及CD25與FLT3-ITD基因的關(guān)系。 方法 通過流式細胞術(shù)檢測CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64及白介素2三條受體鏈CD25（α鏈）、CD122（β鏈）、CD132（γ鏈）在36例AML患者骨髓表達，運用PCR技術(shù)檢測本組患者FLT3-ITD基因的表達。結(jié)果 36例AML患者中， CD25+表達率為13.89%（5/36），在AML-M2組為12.5%（1/8）、AML-M4組為18.18%（2/11）、AML-M5組為20%（2/10），CD25+表達率在各組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。表達CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64、CD122、CD132單克隆抗體的骨髓原始細胞百分比在CD25+AML-M2組和CD25-AML-M2組間、CD25+AML-M4組和CD25-AML-M4組間、CD25+AML-M5組和CD25-AML-M5組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。PCR結(jié)果顯示，7例AML患者出現(xiàn)FLT3-ITD突變基因，5例CD25+AML患者組中FLT3-ITD+者為3例，CD25+AML合并FLT3-ITD+率為60%，高于CD25-AML組（P<0.05）。 結(jié)論 （1）CD25在AML患者中可出現(xiàn)陽性表達，但陽性率較低，CD25與AML患者的FAB亞型和常見的髓系免疫表型標(biāo)記無明顯相關(guān)性；（2）CD25+AML患者合并FLT3-ITD基因突變率較高，明確CD25與FLT3-ITD基因的相關(guān)性有一定臨床意義。

[關(guān)鍵詞] CD25；急性髓細胞白血病；FLT3-ITD基因；流式細胞術(shù)

[中圖分類號] R733.71 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）14-0020-04

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）以分化阻滯的不成熟細胞大量聚集于骨髓為特點，臨床常通過檢查骨髓細胞形態(tài)、免疫標(biāo)記和遺傳學(xué)分析對患者進行診斷。CD25是高度親和白細胞介素2的受體α鏈，可參與抑制CD4+CD25+T細胞增殖，使AML患者對白血病細胞的免疫作用缺陷。已有研究提出，CD25可表達率在Ph+ALL顯著增加，并提示疾病預(yù)后不良[1]。本研究通過流式細胞術(shù)檢測CD25在AML患者骨髓內(nèi)的表達情況，探討其與常用的實驗室免疫標(biāo)記的關(guān)系和FLT3-ITD基因突變分子的潛在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選擇我院36例初診AML患者，男21例，女15例，年齡15～63歲，中位年齡39歲；平均白細胞計數(shù)（WBC）為（11.5±8）×109/L，平均血紅蛋白濃度（Hb）為（83±12.3）g/L，平均血小板計數(shù)（PLT） （48±15.7）×109/L，骨髓原始細胞比例（Marrow blast%）為（89±7）%；參照《血液病診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)》[2]對所有病例進行細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)（MICM）檢查，其中AML-M1 2例，AML-M2 8例，AML-M3 4例，AML-M4 11例，AML-M5 10例，AML-M7 1例。

1.2 PCR檢測

按DNA提取試劑盒（購自TIANGEN）說明書操作。吸取與EDTA抗凝劑混合的骨髓液200 μL，加入20 μL蛋白酶K，混勻。加200 μL緩沖液GB，充分混勻，于56℃恒溫水浴箱放置10 min以上，必要時延長時間使溶液變清亮。加500 μL無水乙醇吹打混勻，若液體黏稠，可再加無水乙醇200 μL，此時可能見到絮狀沉淀。將吸附柱CB3放入收集管并編號，12 000 rpm離心1 min，若觀察到吸附柱堵塞，可將堵塞物吸出后再離心。棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管，加入500 μL緩沖液GD，12 000 rpm離心1 min，棄掉收集管中的廢液。吸附柱放回收集管，加入700 μL漂洗液PW，12 000 rpm離心1 min，丟棄廢液后吸附柱放入收集管。加500 μL漂洗液PW，12 000 rpm離心30 s，丟棄廢液后吸附柱放入收集管。12 000 rpm離心2 min，倒掉廢液。吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，向吸附膜中間位置懸空滴加100 μL去離子水，室溫放置2～5 min，12 000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管，作為FLT3-ITD擴增的DNA模板。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成，F(xiàn)LT3-ITD的上游引物5'-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3'，下游引物5'-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3'。反應(yīng)體系為上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，PCRmix10 μL（購自Takara公司）。PCR反應(yīng)條件：94℃ 6 min，56℃ 1 min，72℃10 min，共30個循環(huán)。制作2%瓊脂糖凝膠，吸取PCR產(chǎn)物5 μL，凝膠成像系統(tǒng)中拍照，判讀結(jié)果。

1.3 流式細胞術(shù)

免疫表型標(biāo)記單克隆抗體CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、 CD16、CD14、CD64、CD25、CD122、CD132等試劑均為美國BD公司產(chǎn)品。①膜抗原檢測：各色熒光單克隆抗體加入流式管中，加入上述EDTA抗凝骨髓液500 μL。室溫孵育20 min，加150 μL溶血素充分混勻，靜置，待溶液透亮無絮狀沉淀，加PBS 1 mL 1000 rpm離心5 min，棄上清。加500 μL PBS后上機檢測。②胞漿抗原檢測：500 μL骨髓液與100 μL固定液孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm離心5 min，棄上清，加100 μL破膜劑混勻靜置觀察溶液透亮后，加PBS 1 mL 1000 rpm離心5 min，棄上清，加搭配好的各色單克隆抗體，常溫、避光孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm離心5 min，棄上清，加500 μL PBS上流式細胞儀檢測。③單克隆抗體表達大于同型對照的20%為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，描述偏態(tài)分布資料為中位數(shù)（Median），描述正態(tài)分布資料為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。Wilcoxon rank sum test進行兩樣本間假設(shè)檢驗，采用Fisher精確概率法進行兩樣本率的比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD25在36例AML患者中的表達結(jié)果

表達CD25的骨髓原始細胞占總骨髓原始細胞百分比>20%共5例，全組CD25+表達率為13.89%（5/36）。CD25分別在AML-M2組表達率為12.5%（1/8）、AML-M4組為18.18%（2/11）、AML-M5組為20%（2/10），余組未檢測到CD25表達。Fisher精確概率法檢驗，CD25+表達率在各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 CD25與36例AML患者免疫表型的相關(guān)性

表達CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64、CD122、CD132單克隆抗體的骨髓原始細胞百分比在CD25+AML-M2組和CD25-AML-M2組間、CD25+AML-M4組和CD25-AML-M4組間、CD25+AML-M5組和CD25-AML-M5組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。36例AML患者均無CD122、CD132表達。

2.3 CD25與FLT3-ITD基因突變的相關(guān)性

PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)LT野生型條帶只有一條，在310 pb附近，當(dāng)FLT出現(xiàn)內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制時，會在正常條帶上方出現(xiàn)分子量大于FLT的條帶（圖1）。在36例AML患者中有7例伴隨FLT3-ITD突變基因，F(xiàn)LT3-ITD的表達率為19.4%（7/36）。5例CD25+AML患者組中FLT3-ITD+者為3例，CD25+AML合并FLT3-ITD+率為60%（3/5），CD25+AML組與CD25-AML組比較，F(xiàn)LT3-ITD+表達差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.044）。

3討論

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML） 病因不明確，治療以化學(xué)治療為主，70%～80%可以達到完全緩解，但多數(shù)患者常因疾病復(fù)發(fā)導(dǎo)致長期生存率僅30%～40%[3]。根據(jù)FAB將AML分為7種亞型，其中急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是一種特殊類型，PML/RARα融合基因是其特征性表達基因分子，通過三氧化二砷及維甲酸聯(lián)合靶向誘導(dǎo)細胞分化治療，90%以上的患者可以獲得治愈。AML免疫表型以表達MPO、CD117、CD13、CD33、CD15、CD64常見，約50%～60%的AML患者可以檢測出異常核型，不同異常核型對AML患者預(yù)后有各自不同影響。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多異常遺傳分子，與白血病的發(fā)病和預(yù)后有深遠的關(guān)系。AML合并AML1/ETO和CBFβ/MYH11融合基因時，對化學(xué)治療敏感，預(yù)后較好，此外在合并有NPM1、CEBPα?xí)r預(yù)后也相對良好。當(dāng)出現(xiàn)復(fù)雜核型、單倍體核型、MLL重排、C-KIT、DNMT3A和FLT3-ITD時，對AML預(yù)后存在不良影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，CD25在BCR/ABL+急性B淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL）患者中呈高水平表達，在長期生存（overall survival，OS）分析方面，診斷為B-ALL伴BCR/ABL融合基因陽性的患者中，合并有CD25+患者的OS較CD25-患者中位OS明顯縮短[4]。因此，CD25作為B-ALL判斷預(yù)后的新生物學(xué)指標(biāo)，提示不良預(yù)后。

本研究對36例AML患者進行CD25抗體標(biāo)記，運用流式細胞術(shù)檢測抗體熒光，探討CD25與AML的相關(guān)性。結(jié)果顯示，本組36例AML患者有5例表達CD25+，表達率為13.89%（5/36）。國外研究在大樣本量（657例）的AML中檢測CD25+表達率為13%，并在不同的骨髓細胞形態(tài)學(xué)階段，即AML-M0～M7間均有表達，各個亞型間CD25+的表達率無明顯差別，而CD11b常表達于CD25+AML，其余髓系免疫表型，如CD33、CD117、CD13、CD15、CD64與CD25相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義[5]。本實驗收集到2例AML-M1、8例AML-M2、4例AML-M3、11例AML-M4、10例AML-M5、1例AML-M7，在AML-M1組、AML-M3組、AML-M7組內(nèi)未檢測到CD25的表達，在AML-M2組、AML-M4組和AML-M5組檢測到并分析了CD25在各組間表達差別均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CD25表達與髓系白血病細胞的不同細胞形態(tài)學(xué)停滯階段無相關(guān)性；同時在各組內(nèi)CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD19、CD16、CD14、CD64在CD25+和CD25-組間表達無統(tǒng)計學(xué)差異，說明CD25與常見的髓系免疫表型分子無明顯相關(guān)性，對AML的診斷意義較低。與國外研究不同的是，本實驗中CD11b在AML-M2組、AML-M4組和AML-M5組內(nèi)的表達情況與CD25無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本實驗收集病例數(shù)較少有關(guān)，不能明確CD25在全部AML中的表達情況，需要擴大樣本量以證明CD11b及其他髓系免疫表型在CD25+AML中的表達情況。

有國外研究提出，CD25+AML中76%的患者合并FLT3-ITD突變[6]。FLT的內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制（ITDs）則形成FLT-ITD突變，翻譯形成異常蛋白信號分子通過下游STAT5信號通路使細胞發(fā)生惡性增殖[6，7]。FLT3-ITD突變在成人AML患者的發(fā)生率約為24%[8]。PCR檢測本組AML患者中有7例FLT3-ITD+，F(xiàn)LT3-ITD+的表達率為19.4%（7/36）。CD25+AML組中FLT3-ITD+表達率為60%（3/5），F(xiàn)LT3-ITD+在CD25+AML組CD25-AML組的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CD25+AML患者合并FLT3-ITD基因突變率較高。AML合并FLT3-ITD突變時提示疾病預(yù)后不良[9]。有研究顯示，CD25+FLT3-ITD+AML患者中位無復(fù)發(fā)生存（relapse free survival，RFS）時間為6個月，較CD25-FLT3-ITD+AML患者中位RFS時間（38個月）明顯縮短，而CD25+FLT3-ITD-和CD25-FLT3-ITD-AML患者的中位RFS時間分別為28、47個月；在FLT3-ITD+AML患者的長期生存（overall survival，OS）分析中，CD25+組的中位OS時間為8個月，較CD25-組25個月的中位OS時間明顯縮短[10]。因此，AML患者合并有FLT3-ITD和CD25表達時，疾病復(fù)發(fā)時間和長期生存時間均縮短，CD25是AML不良預(yù)后的潛在指標(biāo)，但CD25對AML預(yù)后影響的獨立性，仍需要進一步明確。

雖然CD122、CD132在36例AML中未見表達，提示IL-2不能通過受體直接對髓系白血病細胞發(fā)揮生理作用，但IL-15可以通過與IL-2Rα有相似空間結(jié)構(gòu)的IL-15Rα分別與IL-2Rβ、IL-2Rγ組成受體[11]，替代IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途徑，從而對細胞發(fā)揮增殖調(diào)節(jié)作用[12-14]。FLT3-ITD蛋白常通過STAT5信號通路使細胞發(fā)生惡性增殖[7]，從而誘發(fā)白血病。目前IL-2R的Jak-STAT信號傳導(dǎo)途徑與FLT3-ITD蛋白下游STAT5信號通路之間的關(guān)系尚未明確，需要深層次的基礎(chǔ)性研究來解釋。在相關(guān)臨床研究中，已證實CD25對AML患者的預(yù)后存在潛在不良影響，因此明確CD25與AML的相關(guān)性有一定臨床意義。

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（收稿日期：2014-03-18）

雖然CD122、CD132在36例AML中未見表達，提示IL-2不能通過受體直接對髓系白血病細胞發(fā)揮生理作用，但IL-15可以通過與IL-2Rα有相似空間結(jié)構(gòu)的IL-15Rα分別與IL-2Rβ、IL-2Rγ組成受體[11]，替代IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途徑，從而對細胞發(fā)揮增殖調(diào)節(jié)作用[12-14]。FLT3-ITD蛋白常通過STAT5信號通路使細胞發(fā)生惡性增殖[7]，從而誘發(fā)白血病。目前IL-2R的Jak-STAT信號傳導(dǎo)途徑與FLT3-ITD蛋白下游STAT5信號通路之間的關(guān)系尚未明確，需要深層次的基礎(chǔ)性研究來解釋。在相關(guān)臨床研究中，已證實CD25對AML患者的預(yù)后存在潛在不良影響，因此明確CD25與AML的相關(guān)性有一定臨床意義。

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（收稿日期：2014-03-18）

雖然CD122、CD132在36例AML中未見表達，提示IL-2不能通過受體直接對髓系白血病細胞發(fā)揮生理作用，但IL-15可以通過與IL-2Rα有相似空間結(jié)構(gòu)的IL-15Rα分別與IL-2Rβ、IL-2Rγ組成受體[11]，替代IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途徑，從而對細胞發(fā)揮增殖調(diào)節(jié)作用[12-14]。FLT3-ITD蛋白常通過STAT5信號通路使細胞發(fā)生惡性增殖[7]，從而誘發(fā)白血病。目前IL-2R的Jak-STAT信號傳導(dǎo)途徑與FLT3-ITD蛋白下游STAT5信號通路之間的關(guān)系尚未明確，需要深層次的基礎(chǔ)性研究來解釋。在相關(guān)臨床研究中，已證實CD25對AML患者的預(yù)后存在潛在不良影響，因此明確CD25與AML的相關(guān)性有一定臨床意義。

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（收稿日期：2014-03-18）