李海梅，李軍擴(kuò)，杜嫻娟，趙 芳

（1.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院病理科，河南安陽(yáng)455000；2.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000）

免疫組化與熒光原位雜交檢測(cè)乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增的比較分析

李海梅1，李軍擴(kuò)1，杜嫻娟2，趙 芳2

（1.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院病理科，河南安陽(yáng)455000；2.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000）

目的比較觀察免疫組化（IHC）法檢測(cè)乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達(dá)和熒光原位雜交（FISH）法檢測(cè)其HFR-2基因擴(kuò)增在乳腺癌分子靶向治療中的臨床意義。方法采用IHC法及FISH法分別檢測(cè)111例乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達(dá)及HFR-2基因擴(kuò)增情況。結(jié)果111例乳腺癌標(biāo)本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因擴(kuò)增74例，未擴(kuò)增37例。2種檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.625，P＜0.05）。結(jié)論IHC法檢測(cè)HFR-2蛋白可作為乳腺癌患者是否應(yīng)用赫賽汀的初篩，HFR-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者有必要進(jìn)一步進(jìn)行HFR-2基因擴(kuò)增檢測(cè)，來(lái)確定臨床治療是否應(yīng)用赫賽汀。

乳腺癌；HFR-2；免疫組織化學(xué)；熒光原位雜交

近年來(lái)，一些臨床研究［1］表明，20% ～30%的乳腺癌患者存在HFR-2基因擴(kuò)增或蛋白過(guò)表達(dá)的情況，與患者的轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。針對(duì)HFR-2基因的靶向藥物郝賽汀能有效延長(zhǎng)乳腺癌患者的生存期，但是該藥物僅對(duì)HFR-2基因過(guò)表達(dá)的患者有效，因此，檢測(cè)該基因?qū)θ橄侔┗颊叩闹委熀皖A(yù)后有重要的意義，也是指導(dǎo)郝賽汀應(yīng)用的惟一指標(biāo)。目前，檢測(cè)HFR-2狀態(tài)的方法有熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）等。本研究通過(guò)IHC法和FISH法檢測(cè)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院111例乳腺癌患者中HFR-2情況，比較2種方法的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院2011年6月到2012年2月乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行任何治療，經(jīng)病理證實(shí)均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。

1.2 IHC檢測(cè)及結(jié)果判定采用IHC法按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)HFR-2蛋白表達(dá)，一抗及試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，結(jié)果判定參照乳腺癌HFR-2檢測(cè)指南（2009版）執(zhí)行：無(wú)著色為0，任何比例的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色為（+）；＞10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度，完整但不均勻的細(xì)胞膜棕黃著色或＜30%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕黃著色為（++）；＞30%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜棕黃著色為（+++）。由于（+）和（-）均記為陰性，在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)進(jìn)行合并。

1.3 FISH檢測(cè)及結(jié)果判定采用FISH法按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行 HFR-2基因擴(kuò)增的檢測(cè)，該方法可將HFR-2基因標(biāo)記為紅色，17號(hào)染色體基因標(biāo)記為綠色。乳腺癌HFR-2探針試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。主要步驟包括從石蠟包埋組織中獲取4 μm切片，然后進(jìn)行樣本載玻片的預(yù)處理、變性處理、探針與樣本雜交、玻片洗脫和熒光顯微鏡觀察，觀察30個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算Ratio值（Ratio值為30個(gè)細(xì)胞核中紅色信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào)總數(shù)）。Ratio值＜1.8為陰性，提示該樣本無(wú)HFR-2基因擴(kuò)增；Ratio值＞2.2為陽(yáng)性，提示樣本中HFR-2基因擴(kuò)增，紅信號(hào)點(diǎn)成簇?cái)U(kuò)增也記為HFR-2基因擴(kuò)增；Ratio值為1.8～2.2時(shí)，增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)或換一位計(jì)數(shù)者重新計(jì)算，或重做FISH檢測(cè)來(lái)判斷最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，IHC法與FISH法檢測(cè)HFR-2狀態(tài)之間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

111例乳腺癌標(biāo)本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因擴(kuò)增74例，未擴(kuò)增37例。2種檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系（rs= 0.625，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織中HFR-2蛋白表達(dá)和HFR-2基因擴(kuò)增結(jié)果的關(guān)系 n

3 討論

原癌基因HFR-2定位于人的17號(hào)染色體上，編碼相對(duì)分子質(zhì)量185 000的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，是生長(zhǎng)因子受體家庭成員，HFR-2主要是通過(guò)配體與受體結(jié)合形成同源或異源二聚體，進(jìn)一步引起胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基的自身磷酸化，這種磷酸化激活了下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用［2］。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等的細(xì)胞中可檢測(cè)到HFR-2基因擴(kuò)增或蛋白的過(guò)表達(dá)，約20%～30%的乳腺癌組織中HFR-2蛋白會(huì)發(fā)生過(guò)表達(dá)，其中90%以上是由于基因擴(kuò)增造成的。HFR-2基因的擴(kuò)增和蛋白的過(guò)表達(dá)提示對(duì)某些常規(guī)的化療和激素治療反應(yīng)性差，預(yù)后通常較差。針對(duì)HFR-2受體的曲妥珠單抗是一種單克隆抗體，是當(dāng)代乳腺癌靶向治療的代表性藥物。其治療乳腺癌的作用機(jī)制主要是通過(guò)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用殺傷 HFR-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞；介導(dǎo)HFR-2受體的內(nèi)吞降解而減少其在細(xì)胞表面的密度，抑制腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)［3-4］。因此，對(duì)HFR-2基因狀態(tài)的評(píng)估已經(jīng)成為乳腺癌患者采用適當(dāng)治療方法的基本程序［5］。

IHC法是目前臨床常用的檢測(cè)HFR-2受體蛋白表達(dá)的方法。該方法簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)性好。但由于其檢測(cè)對(duì)象為HFR-2受體蛋白，在標(biāo)本固定和處理中可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性破壞而影響檢測(cè)結(jié)果，還有17號(hào)染色體的非整倍體現(xiàn)象會(huì)使檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，加上結(jié)果主觀判斷的誤差等，可直接影響結(jié)果的可靠性。FISH法是分子遺傳學(xué)常用的檢測(cè)技術(shù)，不僅可以用于異常染色體的檢測(cè)，也可以用于觀察目標(biāo)基因的擴(kuò)增情況，具有高穩(wěn)定性、高準(zhǔn)確性和高靈敏性的特點(diǎn)。特別是在乳腺癌患者 HFR-2的檢測(cè)方面，目前認(rèn)為FISH法是檢測(cè)HFR-2這條FGFR通路是否過(guò)度活化的金標(biāo)準(zhǔn)。研究［6］顯示，這2種方法的檢測(cè)結(jié)果之間相關(guān)性較好。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在53例HFR-2蛋白（+++）的病例中有50例基因有擴(kuò)增，3例基因?yàn)槲磾U(kuò)增；在47例HFR-2蛋白（++）的病例中有24例基因有擴(kuò)增，23例基因未擴(kuò)增（其中有4例為多體未擴(kuò)增）；11例HFR-2蛋白（+）或（-）的病例均未見(jiàn)基因未擴(kuò)增。結(jié)果表明在蛋白表達(dá)為（+++）和（+）或（-）的組別中2種檢測(cè)方法的符合率較高，而在蛋白表達(dá)為（++）的組別中符合率較低，值得注意的是在23例基因未擴(kuò)增的HFR-2蛋白（++）病例中，有4例為多體未擴(kuò)增，趙坡等［7］的研究顯示17號(hào)染色體多體的乳腺癌赫賽汀用藥組患者較未用藥組復(fù)發(fā)率低。至于17號(hào)染色體與乳腺癌患者的用藥選擇、預(yù)后等關(guān)系，國(guó)內(nèi)外可參考的文獻(xiàn)尚少，需要進(jìn)一步更深入的研究。綜合本文初步結(jié)果，我們認(rèn)為臨床應(yīng)用IHC法檢測(cè)乳腺癌HFR-2蛋白表達(dá)具有一定的準(zhǔn)確度，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)乳腺癌患者的診斷治療及預(yù)后情況有一定的指導(dǎo)作用。但是本研究顯示，IHC法與具有高度穩(wěn)定性和可靠性的FISH法結(jié)果相比較，存在部分假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。綜上所述，IHC法檢測(cè)HFR-2蛋白可作為乳腺癌患者是否應(yīng)用赫賽汀的初篩，HFR-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者有必要進(jìn)一步進(jìn)行HFR-2基因擴(kuò)增檢測(cè)，來(lái)確定臨床治療是否應(yīng)用赫賽汀。

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Comparative Analysis of Immunohistochemistry and Fluorescence in Situ Hybridization in Detecting HER-2 in Breast Cancer

Li Haimei1，Li Junkuo1，Du Xianjuan2，Zhao Fang2
（1.Department of Pathology，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China；2.Molecular Biology Laboratory，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of HFR-2 protein expression detected by immunohistochemistry（IHC）and HFR-2 gene amplification detected by fluorescence in situ hybridization（FISH）in molecular targeting therapy of breast cancer.MethodsThe HFR-2 protein expressions and the HFR-2 gene amplification in the 111 cases of breast cancer tissues were detected by IHCa nd FISH，respectively.ResultsThe numbers of patients showed IHC（+++），IHC（+++）and IHC（+/-）were 53 cases，47 cases and 11 cases，respectively.The HFR-2 gene amplification existed in the 74 cases，no amplification existed in the 37 cases.There was positive correlation between the two results（rs=0.625，P＜0.05）.ConclusionBefore herceptin therapy，the immunohistoche-mistry can be first used to detect the HFR-2 protein expressions，and then in the cases woth positive expressions of HFR-2，the HFR-2 gene amplifications should be further tested to guide the herceptin therapy in the treatment of breast cancer.

breast cancer；HFR-2；immunohistochemistry；fluorescence in situ hybridization

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.004

R737.9

A

1673-5412（2014）03-0196-03

2013-04-19）

李海梅（1980-），女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤病理診斷及研究。F-mail：296156543@qq.com