李文仿，歐 琴，張 華，趙宗彬，王 耕

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，湖北十堰442000）

木犀草素抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4通路的作用

李文仿1，歐 琴2，張 華1，趙宗彬1，王 耕1

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院普外三科，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，湖北十堰442000）

目的探討木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中SDF-1α/CXCR4信號(hào)通路抑制作用。方法采用不同濃度的木犀草素處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，觀察乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞增殖、趨化運(yùn)動(dòng)及CXCR4蛋白表達(dá)。結(jié)果木犀草素明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 CXCR4蛋白表達(dá)，并明顯抑制SDF-1α/CXCR4對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的激活。結(jié)論木犀草素可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖及SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的信號(hào)激活作用，在預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移中可能有重要的作用。

木犀草素；乳腺癌；CXCR4

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率正在逐年升高，而且日趨年輕化，給患者生活帶來(lái)嚴(yán)重不良影響。最近研究［1］發(fā)現(xiàn)木犀草素是一種在各種蔬菜及水果中廣泛分布的天然黃酮化合物，具有抗腫瘤作用，可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制抑制甲狀腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2、J5）等10多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖作用，具有很好的抗腫瘤前景。

CXCR4與其特異性配體在乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌等多種腫瘤趨化轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制多種腫瘤細(xì)胞侵襲，轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞較正常乳腺細(xì)胞的CXCR4表達(dá)明顯增高，而在乳腺癌高轉(zhuǎn)移的靶器官肝、骨髓及肺中高表達(dá)其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α），推測(cè)SDF-1α/ CXCR4介導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)移［2］。拮抗乳腺癌細(xì)胞中CXCR4功能在減少乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3］，提示CXCR12/CXCR4能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向特異性的部位“歸巢”，即誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞器官特異性的轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231存在高表達(dá)CXCR4，并且后者與MDA-MB-231細(xì)胞惡性程度及高轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、侵襲密切相關(guān)。本研究探討木犀草素對(duì)MDA-MB-231的增殖及SDF-1α/CXCR4信號(hào)通路激活抑制作用，并觀察其作為乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移抑制治療輔助措施的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海保藏中心，細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素的DFMN培養(yǎng)基中，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，CXCR4單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，p-AKT、GADPH及PI3K單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 用DFMN培養(yǎng)基調(diào)整乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231濃度為1.5×105 mL-1，將2 mL調(diào)整濃度后的細(xì)胞均勻貼壁在6孔培養(yǎng)皿，3 h后，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231完全貼壁，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基換為含濃度為0、6、12 μg·mL-1木犀草素的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔并取其均值，分別于培養(yǎng)后24 h、48 h、72 h計(jì)數(shù)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。

1.2.2 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 選擇直徑為8 μm的Trans well趨化小室，基底用膠原蛋白包被30 min后將Trans well趨化小室倒置，將100 μL調(diào)整細(xì)胞濃度后的培養(yǎng)基置于趨化小室基底，貼壁4 h后輕輕吸去培養(yǎng)基，將趨化小室倒置在含木犀草素0、6、12 μg·mL-1的500 μL培養(yǎng)基的下室培養(yǎng)12 h，然后將趨化小室上室培養(yǎng)基換為含100 ng·mL-1的SDF-1α的培養(yǎng)液，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231趨化運(yùn)動(dòng)4 h后，棉簽輕輕刮去沒(méi)有發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞，將小室基底以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%甲苯胺藍(lán)的40 g·L-1低聚甲醛染色1 h，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野的已經(jīng)發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞。

1.2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn) 將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分別用12 μg·mL-1的木犀草素處理24 h、48 h，然后提取蛋白，取100 μg等量蛋白做Western Blot實(shí)驗(yàn)，在體積分?jǐn)?shù)10%分離膠上等蛋白條帶分離清晰，以硝酸纖維薄膜轉(zhuǎn)膜，PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入濃度為1∶1 000的CXCR4（或PI3K）一抗，4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入顯色劑，X光機(jī)讀片。

1.2.4 木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 SDF-1α信號(hào)激活抑制作用研究乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231用12 μg·mL-1的木犀草素培養(yǎng)基分別處理0 h、24 h和48 h，然后，觀察含100 ng·mL-1SDF-1α培養(yǎng)基處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 10 min后對(duì)AKT激活作用。取含磷酸化酶抑制劑的RIPA液裂解細(xì)胞，并將100 μg蛋白進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)，在體積分?jǐn)?shù)10%分離膠上等蛋白條帶分離清晰，以硝酸纖維薄膜轉(zhuǎn)膜，PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清封閉1 h，然后分別加入濃度為1：1 000的p-AKT的一抗4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次10 min，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h，PBS洗滌3次，每次10 min后加入顯色劑，X光機(jī)讀片。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，6、12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h及72 h均可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素較6 μg·mL-1木犀草素抑制細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 木犀草素抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的結(jié)果

2.2 木犀草素抑制SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化運(yùn)動(dòng)及CXCR4表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中具有高表達(dá)CXCR4的臨床特點(diǎn)，而且高表達(dá)CXCR4與乳腺癌細(xì)胞趨化轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)木犀草素處理12 h后，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化活性完全被抑制，12 μg·mL-1木犀草素幾乎完全抑制了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的趨化運(yùn)動(dòng)（表2）。Western Blot檢測(cè)CXCR4蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)12 μg·mL-1木犀草素作用24 h、48 h可顯著抑制CXCR4蛋白表達(dá)（圖1）。

表2 木犀草素對(duì)SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化抑制作用

圖1 Western Blot檢測(cè)CXCR4蛋白表達(dá)

2.3 木犀草素抑制 SDF-1α對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MDAMB-231的信號(hào)激活本實(shí)驗(yàn)表明，乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231經(jīng)含SDF-1α濃度為100 ng·mL-1培養(yǎng)基作用10m in后，可明顯激活乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 AKT信號(hào)通路，但是經(jīng)12 μg·mL-1木犀草素處理24 h、48 h后，AKT信號(hào)通路可明顯被抑制。PI3K激酶在AKT激活中發(fā)揮重要作用，木犀草素可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中PI3K的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 木犀草素對(duì)SDF-1α對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的信號(hào)激活的抑制圖像

3 討論

目前，乳腺癌的治療包括傳統(tǒng)的乳腺癌改良根治術(shù)，乳腺癌被認(rèn)為是全身性疾病，即使是早期乳腺癌，診斷時(shí)也有早期血液轉(zhuǎn)移，因此，主張手術(shù)后行規(guī)范的化療，但化療藥物一般均有毒副反應(yīng)重、對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性差，尤其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致患者死亡。最近研究［4-6］報(bào)道日常膳食中的黃酮化合物木犀草素有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDAMB-231凋亡作用，抑制FGF對(duì)AKT及FRK的激活，可增加乳腺癌細(xì)胞Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-xl表達(dá)，同時(shí)抑制FGF介導(dǎo)的MAPP信號(hào)通路的激活。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有FR、PR受體陰性，Her2也表達(dá)陰性，高度侵襲、轉(zhuǎn)移的特征，臨床治療化療不敏感，容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅患者生命健康。本組結(jié)果表明，木犀草素可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，12 μg·mL-1木犀草素抑制癌細(xì)胞增殖作用更為明顯，提示木犀草素具有抗乳腺癌潛能。

CXCL12也稱為SDF-1α，生理情況下廣泛分布于免疫器官、腦、心、肝、腎和肺等組織。CXCR4是7次穿膜的G蛋白偶聯(lián)受體，與SDF-1α相互作用，構(gòu)成的SDF-1α/CXCR4生物學(xué)軸介導(dǎo)細(xì)胞遷移，與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Müller等［2］在2001年首次研究了趨化因子在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的功能，發(fā)現(xiàn)乳腺癌常轉(zhuǎn)移至骨髓、肺和肝臟等高表達(dá)CXCL12的部位，而很少轉(zhuǎn)移到腎臟、皮膚、肌肉等低表達(dá)CXCL12的部位。CXCR4特異性抑制劑可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231肺轉(zhuǎn)移［7］。CXCR4表達(dá)水平與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)，CXCR4的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度及預(yù)后相關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，木犀草素可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中CXCR4蛋白表達(dá)，抑制SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的乳腺癌趨化運(yùn)動(dòng)。

本研究也發(fā)現(xiàn)SDF-1α可明顯激活A(yù)KT，從而促使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)移，但木犀草素明顯抑制了乳腺癌中AKT的激活。因此，我們的研究表明，木犀草素抑制了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，而且抑制了SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化運(yùn)動(dòng)，明顯抑制CXCR4蛋白表達(dá)，抑制SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的AKT激活，表明木犀草素是潛在的重要的天然抗腫瘤物質(zhì)。

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Inhibition Effect of Luteolin on SDF-1α/CXCR4 Signal Pathway in Breast Cancer Cells MDA-MB-231

Li Wenfang1，Ou Qin2，Zhang Hua1，Zhao Zongbing1，Wang Geng1
（1.Department of General Surgery，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；2.Department of Microbiology，School of Basic Medical Science，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

ObjectiveTo study the inhibition Fffect of luteolin on SDF-1α/CXCR4 signal pathway in breast cancer cells MDA-MB-231.MethodsDifferent concentrations of luteolin were used to treat breast cancer cells MDA-MB-231，the cell enhancement，chemotactic migration and expression of CXCR4 were observed in breast cancer cells MDA-MB-231.ResultsLuteolin inhibited significantly the cell proliferation，the expression of CXCR4 and SDF-1α/CXCR4 activation in the breast cancer cells of breast cancer cells MDA-MB-231.ConclusionLuteolin can inhibit the cell proliferation and SDF-1α/CXCR4 signal activation of breast cancer cells MDA-MB-231，and may be important in the prevention of recurrence and metastasis of breast cancer.

luteolin；breast cancer；CXCR4

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412（2014）03-0199-04

2013-10-13）

李文仿（1979-），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺外科方面的研究。F-mail：2671422764@qq.com

王耕（1966-），男，主任醫(yī)師，主要從事乳腺外科方面的研究。