何明祥

(福建省福州市工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術(shù)中心,福建福州 350008)

蛇六谷是上海地區(qū)魔芋的俗稱(chēng),為天南星科魔芋和疏毛魔芋的塊莖,有化痰散結(jié)、行瘀消腫等功效[1-2],是最早被用于治療癰癤、腫、毒的特色藥材之一.據(jù)相關(guān)報(bào)告[3-5],蛇六谷具有抗腫瘤功效,現(xiàn)廣泛用于各種癌腫,為治療腫瘤的特色藥材之一[6-9].目前的蛇六谷研究大多集中在中藥水煎劑,同時(shí)大多研究直接采用提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),未進(jìn)行分離純化,活性物質(zhì)成分不明,結(jié)構(gòu)分析未見(jiàn)報(bào)道,不利于作用機(jī)理的研究[10-11].

本課題以蛇六谷為研究對(duì)象,利用自制蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物,通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子抗腫瘤作用,為蛇六谷葡甘聚糖的抗腫瘤作用及其機(jī)制提供有效依據(jù),希望為蛇六谷這一抗癌中藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論指導(dǎo).

1　材料與儀器

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

昆明種小鼠,質(zhì)量18～22 g,由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;宮頸癌細(xì)胞株(HeLa細(xì)胞),中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所腫瘤室提供;S180腹水型肉瘤小鼠,引自陜西省中醫(yī)藥研究院;蛇六谷葡甘聚糖,用超聲波法制得.

1.2　儀器設(shè)備

HH-4型恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市宏華儀器廠;RE-52型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;DZF-6021型真空干燥箱,上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LGJ型冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;AUW220D型電子天平,日本島津公司;離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠;CO-15AC CO2型恒溫培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái),蘇凈安泰;XDS-18型生物倒置顯微鏡,重慶水電儀器總公司;TE2000型倒置熒光顯微鏡,日本NIKON公司;DSX-280A型不銹鋼滅菌鍋,上海申安醫(yī)療設(shè)備.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子預(yù)處理[12-14]

精密稱(chēng)取蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子50 mg,溶解于200μL二甲基亞砜(DMSO)中,旋轉(zhuǎn)震蕩,待全部溶解后,0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾,少量分裝后-20℃保存,將其質(zhì)量濃度稀釋為250 g/L.

2.2　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)HeLa增殖的抑制率測(cè)定[12-13,15-16]

1)將人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞株接種在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清中,加入具有1%抗生素、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

2)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,接種到96孔培養(yǎng)板.

3)每孔0.1 mL,培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞完全貼壁后,加入用RPMI-1640培養(yǎng)液配制的各濃度樣品(50,100,200,400,800μmol/L),每個(gè)濃度均做 3個(gè)復(fù)孔.

4)培養(yǎng)48 h后,每孔加入MTT 15μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心條件棄去上清液,加入150μL DMSO,振蕩10 min,于酶標(biāo)儀上在490 nm進(jìn)行比色測(cè)定,其平均值為細(xì)胞存活的光密度,計(jì)算每個(gè)樣品的細(xì)胞抑制率.

2.3　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及胸腺、脾指數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)[14,16-17]

昆明小鼠,雄性,4～6周齡,體重(20±2)g,自由進(jìn)食.從預(yù)先培養(yǎng)的荷瘤小鼠腹腔中抽出含S180的腹水,用無(wú)菌生理鹽水稀釋.搖勻后,取此細(xì)胞液加臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)染色,計(jì)數(shù),細(xì)胞存活率在95%以上.將S180細(xì)胞懸液0.2 mL接種于實(shí)驗(yàn)小鼠的右前肢腋皮下,制備移植瘤模型.接種24 h后稱(chēng)小鼠體重,并隨機(jī)分為5組.空白對(duì)照組與環(huán)磷酰胺25 mg/(kg·d)組分別為陰、陽(yáng)性對(duì)照組,過(guò)氧乙酸(PPA)用無(wú)菌生理鹽水溶解,從高到低設(shè)4個(gè)劑量組,分別為600,400,200,100 mg/(kg·d).接種24 h后灌胃給藥,每天1次,共給藥10 d.停藥后第2天脫頸處死荷瘤小鼠,稱(chēng)體重,分離瘤塊等稱(chēng)重.

3　結(jié)果與分析

3.1　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

表1為蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子與HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系.從表1可以看出,隨著蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子質(zhì)量濃度的增大,HeLa細(xì)胞吸光度降低,對(duì)其生長(zhǎng)的抑制率逐漸提高,當(dāng)蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子質(zhì)量濃度達(dá)到8.0 g/L時(shí),對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)到10.98%.實(shí)驗(yàn)表明,在一定濃度范圍內(nèi),HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的質(zhì)量濃度成正相關(guān),因此,蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子能夠抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng),但總體抑制效果不明顯.

表1　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Tab.1　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli on growth of HeLa cells

表2　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重的影響Tab.2　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amor-phophalli on tumor weight of S180 tumor bearing mice

3.2　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及胸腺、脾指數(shù)的影響

表2為蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子與S180荷瘤小鼠瘤重的關(guān)系.從表2可以看出,在生理鹽水實(shí)驗(yàn)組中,經(jīng)檢測(cè)S180荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量為0.904 4 g;當(dāng)加入低濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),腫瘤質(zhì)量為0.814 2 g,抑制率為9.97%;當(dāng)加入中濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),腫瘤質(zhì)量為0.637 3 g,抑制率為29.53%;當(dāng)加入高濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),腫瘤質(zhì)量為0.587 7 g,抑制率為35.02%.結(jié)果表明,不同劑量蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤的增長(zhǎng)都有抑制作用,且隨著劑量的增大,抑制效果越明顯,但當(dāng)劑量達(dá)到一定值時(shí),劑量繼續(xù)增大,抑制率不再變化;同時(shí)蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的抑瘤效果要明顯低于陽(yáng)性對(duì)照樣品環(huán)磷酰胺.

表3為蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子與S180荷瘤小鼠胸腺、脾指數(shù)的關(guān)系.從表3可以看出,當(dāng)加入低濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),胸腺指數(shù)為8.7×10-4,脾指數(shù)為6.64×10-3;當(dāng)加入中濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),胸腺指數(shù)為9.7×10-4,脾指數(shù)為7.25×10-3;當(dāng)加入高濃度的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子時(shí),胸腺指數(shù)為9.7×10-4,脾指數(shù)為8.03×10-3.結(jié)果表明,不同劑量蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子都可以提高S180荷瘤小鼠胸腺、脾指數(shù),但低劑量蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)胸腺指數(shù)影響不大,同時(shí)當(dāng)劑量達(dá)到一定值時(shí),劑量繼續(xù)增大,胸腺、脾指數(shù)不再變化.

表3　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子對(duì)S180荷瘤小鼠胸腺、脾指數(shù)的影響Tab.3　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli on thymus and spleen indexes of S180 tumor bearing mice

4　蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

4.1　蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的X射線衍射分析

X射線衍射分析方法可用來(lái)分析物質(zhì)內(nèi)部原子在空間分布狀況的結(jié)構(gòu),根據(jù)獲取到的衍射圖譜判斷物質(zhì)的構(gòu)型.蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的X射線衍射圖見(jiàn)圖1.圖1中,衍射圖譜在16°這個(gè)位置附近出現(xiàn)了相對(duì)較強(qiáng)的結(jié)晶峰,這說(shuō)明提取出的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子中存在結(jié)晶有序結(jié)構(gòu),而無(wú)序結(jié)構(gòu)則會(huì)呈現(xiàn)出一個(gè)饅頭狀的彌散環(huán).這說(shuō)明經(jīng)過(guò)超聲波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子是由β-型糖苷鍵鏈接的,其可能具有較好的抗腫瘤活性.

圖1　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的X射線衍射圖Fig.1　X-ray diffraction of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.2　蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的紅外光譜分析

紅外光譜可以測(cè)定蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的糖苷鍵構(gòu)型及觀測(cè)其他官能團(tuán).蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的紅外光譜見(jiàn)圖2,從圖2可知,在885 cm-1附近存在的吸收峰表明,體系中含有β-糖苷鍵,說(shuō)明超聲波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子中存在β鍵,這與X射線衍射分析的結(jié)果相符.而圖中在3 430 cm-1處有O—H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰,說(shuō)明此條件下體系含有大量的羥基(—OH),其在分子間締合時(shí),可以形成以氫鍵相連的多聚體,吸收位置移向更低波數(shù);在2 920 cm-1出現(xiàn)吸收峰,此處是甲基與亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)峰,而在1 640 cm-1附近出現(xiàn)═C O吸收峰,峰形尖銳,顯示體系分子鏈中有乙酰基存在.

圖2　蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的紅外光譜Fig.2　Infrared spectroscopy of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.3　蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的拉曼光譜分析

為了進(jìn)一步了解分子振動(dòng)的信息,在紅外光譜的基礎(chǔ)上,進(jìn)而對(duì)降解后的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子進(jìn)行拉曼光譜分析,見(jiàn)圖3.根據(jù)圖3及結(jié)合蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子結(jié)構(gòu)研究的有關(guān)理論,對(duì)圖3中各拉曼光譜吸收峰進(jìn)行歸類(lèi)分析,結(jié)果如表4.

圖3 蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的拉曼光譜Fig.3　Raman spectra of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

圖3中,蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子的C—H的伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在2 900,1 118,1 090 cm-1處,C—O—C的伸縮振動(dòng)則出現(xiàn)在905 cm-1處.

表4　蛇六谷葡甘聚糖樣品的激光拉曼光譜吸收峰歸屬Tab.4　Laser Raman band assignments of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.4　蛇六谷葡甘聚糖降解產(chǎn)物的圓二色譜分析

利用圓二色譜(CD)可以對(duì)高分子物質(zhì)的高級(jí)構(gòu)象進(jìn)行分析,通過(guò)測(cè)定高分子溶液的圓二色譜可以研究其構(gòu)象和其轉(zhuǎn)變規(guī)律[1],尤其是揭示了蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及部分參數(shù),并被研究者嘗試應(yīng)用于多糖構(gòu)像的研究[2-3].圖4為超聲波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子在水溶液中的CD譜圖,圖中,在波長(zhǎng)為180～400 nm時(shí),蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子在226 nm處出現(xiàn)顯著負(fù)cotton效應(yīng),說(shuō)明蛇六谷葡甘聚糖短鏈分子在水溶液中以有序的螺旋結(jié)構(gòu)存在.

圖4　蛇六谷葡甘聚糖的圓二色譜Fig.4　CD spectra of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

5　結(jié) 論

參考文獻(xiàn)：