許承明，康健，王麗梅，韓文東，孫志平，丁悅娜，瞿滌,3，柏銀蘭，徐志凱

1. 第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)與病原生物學(xué)教研室，西安 710032； 2. 上海復(fù)旦大學(xué)三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)引起的一種慢性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報告顯示，全球每年約有900萬新增結(jié)核病患者。我國是僅次于印度的結(jié)核病第二大流行國家，年發(fā)病人數(shù)達(dá)120萬[1]，因此迫切需要研究新型的預(yù)防和治療手段以控制結(jié)核病的流行。目前結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)療法為直接督導(dǎo)下的短程化療(directly observed treatment, short-course，DOTS)，療程至少6個月，而耐藥、多重耐藥結(jié)核病的治療周期需延長至12個月，甚至24個月以上[2]。目前認(rèn)為，在藥物及機(jī)體免疫力的雙重壓力下，結(jié)核分枝桿菌可轉(zhuǎn)變?yōu)槌至艟?persister)而長期存在于體內(nèi)，逃避藥物和免疫系統(tǒng)的殺傷，成為結(jié)核病難以根治的主要原因，并成為其復(fù)發(fā)的源頭[3]。因此，了解藥物作用下感染機(jī)體的免疫應(yīng)答，有利于開發(fā)可用于免疫清除結(jié)核分枝桿菌感染的新型疫苗和藥物。動物模型是研究結(jié)核病致病機(jī)制和開發(fā)疫苗、藥物的重要工具，小鼠模型因其遺傳背景清楚、檢測試劑全面、遺傳改造相對容易、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，目前仍是結(jié)核病研究中使用最廣泛的模型[4]。雖然現(xiàn)有小鼠模型已應(yīng)用于疫苗和藥物篩選研究，但對其在感染和化學(xué)藥物治療過程中的免疫特征還缺乏深入研究[5]。本研究構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染小鼠模型，并觀察感染后及化學(xué)藥物治療后小鼠的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答變化，以期為結(jié)核病治療性疫苗、藥物的研發(fā)和篩選提供相應(yīng)的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株結(jié)核分枝桿菌H37Rv株購自中國藥品生物制品檢定所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2培養(yǎng)基及藥物Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基、增菌液OADC均購自BD公司。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Hyclone公司。異煙肼和利福平均購自Sigma公司。

1.1.3生化試劑酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)包被用結(jié)核分枝桿菌抗原為本室制備。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗鼠總IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體均購自Abcam公司。流式細(xì)胞術(shù)用抗體APC/Cy7標(biāo)記抗CD4抗體(熒光標(biāo)簽：識別抗原)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記抗γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)抗體、APC標(biāo)記抗白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)抗體、PE標(biāo)記抗IL-4抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)抗體，以及標(biāo)記液、染色液、固定液均購自Biolegend公司。四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色劑購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司，細(xì)胞因子染色刺激用丙二醇甲醚醋酸酯(propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)及布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)均購自Biolegend公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6雌性小鼠48只，4～6周齡，體重18～22 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司﹝許可證號：SCXK(滬)：2012-0002﹞。

1.2 方法

1.2.1菌液制備保存菌種室溫復(fù)蘇后，接種于Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)3周，將菌液制備成分散的懸液后，1 ml分裝，-80 ℃保存，使用前以平板法進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌抗原制備結(jié)核分枝桿菌H37Rv接種于Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周后混勻；取10 ml菌液3 000g離心5 min，收集，用10 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次；1 ml 裂解液﹝500 mmol/L Tris-HCl pH 7.0、130 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、 蛋白酶抑制劑混合物、0.4%(V/V)吐溫20﹞重懸，80 ℃加熱40 min，滅活后轉(zhuǎn)移至含有0.1 mm聚苯乙烯珠的破碎管，置Biospec震蕩破碎器Hi檔打碎100 s后立即置于冰上；將破碎后液體于4 ℃ 10 000g離心5 min，吸取上清液，置-20 ℃保存。使用前在室溫下溶解，采用Bradford法測定蛋白濃度[6]。

1.2.3感染模型的建立將C57BL/6分為對照組(n=18)、感染組(n=18)和治療組(n=12)。其中感染組和治療組采用尾靜脈注射方式感染，劑量為每只1×105CFU/200 μl，對照組注射200 μl生理鹽水。治療組感染4周后，給予105 mg/L利福平和108.5 mg/L 異煙肼飲水治療。所有結(jié)核分枝桿菌感染小鼠操作均在上海復(fù)旦大學(xué)生物安全三級(biosafety level 3，BSL-3)防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行(認(rèn)可編號：CNAS BL0021，衛(wèi)BSL3-010)。實(shí)驗(yàn)小鼠給予充足飲水和食物，12 h光照。

1.2.4小鼠血清IgG抗體檢測感染12 周時每組取小鼠6只，分別給予腹腔0.1 ml 0.1%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，將血液于37 ℃靜置1 h，4 ℃ 3 000 r/min離心 5 min，收集血清，-20 ℃保存。用10 μg/ml結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白包被ELISA用96孔板，每孔100 μl，4 ℃過夜。PBS洗3次，加入5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉液，37 ℃封閉1 h。用PBS洗后，各孔分別加入1∶100稀釋的被檢小鼠血清(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400共8個稀釋度的比較結(jié)果，選擇1∶100稀釋度)，每孔100 μl，37 ℃孵育1 h。PBS洗5次，分別加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶10 000)、IgG1(1∶5 000)、IgG2a(1∶5 000)、IgG2b(1∶5 000)、IgG3(1∶5 000)抗體，每孔100 μl，37 ℃孵育1 h。用PBS洗后，加入TMB顯色10 min。最后用50 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，檢測450 nm處的光密度(optical density，OD)值。

1.2.5感染小鼠肺、脾荷菌計(jì)數(shù)于感染后4、8、12周，每組分別取6只小鼠麻醉后處死，無菌解剖，取出全部肺和脾，置于細(xì)胞篩上；加入5 ml PBS，用注射器針芯充分研磨后，各取1 ml，10倍系列稀釋；分別取100、10-1、10-2稀釋度各100 μl懸液，涂布于Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)3周。根據(jù)平板菌落數(shù)，選取30～150 CFU平板作為計(jì)數(shù)結(jié)果，取平板CFU數(shù)×相應(yīng)研磨液稀釋倍數(shù)×50(研磨液5 ml/涂布液0.1 ml)所得數(shù)值的對數(shù)，作為全肺或全脾組織的荷菌數(shù)(lg CFU)。

1.2.6小鼠脾淋巴細(xì)胞分離及體外刺激培養(yǎng)將余下各組小鼠脾細(xì)胞懸液2 000 r/min離心5 min，棄上清液；沉淀物加入2 ml ACK紅細(xì)胞裂解液，作用2 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清液；10 ml PBS洗滌后，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，3%臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整密度為2×107個/ml，接種于圓底96孔板，100 μl/孔。分別加入10 μl PMA(終濃度0.1 μg/ml)和離子霉素(終濃度1 μg/ml)作為陽性對照，結(jié)核分枝桿菌抗原刺激孔加入10 μl純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)(終濃度10 μg/ml)，加入同體積PBS為陰性對照。37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)20 h，加入10 μl BFA(終濃度1 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2.7抗原特異性脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)分析收集體外抗原刺激后的脾淋巴細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入50 μl含表面分子抗體CD4的標(biāo)記液混勻，4 ℃避光孵育30 min；200 μl標(biāo)記液洗3次，加入50 μl固定液重懸，室溫避光固定20 min；200 μl破膜液洗2次，加入含有細(xì)胞因子抗體的破膜液50 μl重懸，室溫避光20 min；破膜液洗2次，洗滌液再洗2次，200 μl固定液固定，4 ℃避光保存至上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染小鼠肺、脾的荷菌數(shù)

如圖1所示，感染后4周，小鼠肺和脾的荷菌數(shù)分別達(dá)到3.67±0.25和3.54±0.24；感染后8 周，感染組肺荷菌量上升至4.39±0.75，高于4 周時的荷菌數(shù)(P<0.05)，而脾荷菌數(shù)增加不明顯，為3.83±0.68(P>0.05)；感染后12周，肺和脾的荷菌數(shù)分別達(dá)4.63±0.61和3.67±0.89。表明采用藥物治療可有效降低臟器荷菌數(shù)。與感染組相比，治療4 周后(感染后8 周)，脾、肺荷菌量顯著下降，分別為2.13±1.04和1.89±1.47(P<0.01和P<0.05)；而治療8周后(感染后12 周)，肺荷菌量顯著下降，實(shí)驗(yàn)組6只小鼠中4只肺勻漿液培養(yǎng)無菌落生成，所有小鼠脾勻漿液培養(yǎng)無菌落生成。

At 4, 8 and 12 weeks after infection, 6 mice from untreated group (UN) and chemotherapy-treated group (CH) were sacrificed to determine the bacterial loads in the lung and spleen. Chemotherapy was started at 4 weeks after infection till to 12 weeks. A: Bacterial loads in the lung of untreated and chemotherapy-treated mice at different time points. B: Bacterial loads in the spleen of untreated and chemotherapy-treated mice at different time points.

2.2 小鼠血清特異性抗體檢測及亞類分析

感染后12周，感染組和治療組小鼠血清中均可檢出抗結(jié)核分枝桿菌特異性IgG抗體；治療組血清特異性IgG抗體水平顯著低于感染組(P<0.01)，但仍高于對照組(P<0.05)(圖2)。

At 12 weeks after infection, sera from mice were collected and diluted in 1∶100 with PBS, and then IgG level was detected by ELISA and read at 450 nm. *P<0.05, **P<0.01 in a one-tailed t-test.

如圖3A所示，與對照組相比，感染組血清中IgG1和IgG2a抗體亞類水平均顯著升高(P<0.01和P<0.01)；治療組血清中IgG1和IgG2a抗體亞類水平均高于對照組(P<0.05和P<0.01)，其中IgG2a水平也高于感染組(P<0.05)，而IgG1水平則低于感染組(P<0.01)；各組IgG2b和IgG3亞類抗體水平均無顯著差異(P>0.05)。感染組IgG2a/IgG1比值與對照組相比無顯著變化(P>0.05)，而治療組IgG2a/IgG1比值顯著高于感染組和對照組(P<0.01和P<0.01)(圖3B)。

2.3 抗原特異性脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)情況

感染后12周，無菌分離各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，體外PPD刺激并培養(yǎng)后采用細(xì)胞因子抗體胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α的細(xì)胞比例。如圖4所示，與對照組相比，感染組表達(dá)IFN-γ和IL-2的CD4+脾淋巴細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01和P<0.001)，而表達(dá)IL-4的細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)。治療組表達(dá)IFN-γ的CD4+脾細(xì)胞比例變化不顯著，而表達(dá)IL-2的CD4+脾細(xì)胞比例與感染組相反，顯著下降(P<0.05)，表達(dá)IL-4的細(xì)胞比例則與感染組相似，呈下降趨勢(P<0.01)。與對照組相比，感染組和治療組表達(dá)TNF-α的CD4+脾淋巴細(xì)胞比例均無顯著變化(P>0.05)。

At 12 weeks after infection, sera from mice were collected and diluted in 1∶100 with PBS, and then IgG level was detected by ELISA and read at OD450. A: IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 levels in sera. B: IgG2a/IgG1 ratio in sera. *P<0.05, **P<0.01 in a one-tailed t-test.

At 12 weeks after infection, 6 mice were sacrificed and splenocytes were separated and cultured with purified protein derivative(PPD) for 20 h, then the percentage of IFN-γ，IL-2，IL-4 and TNF-α expressing cells were identified by intracellular cytokine staining and flow cytometry. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 in a one-tailed t-test.

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型是結(jié)核病研究中最常用的動物模型。C57BL/6品系小鼠因其易建立結(jié)核分枝桿菌感染且臟器荷菌量相對較高的特點(diǎn)，成為結(jié)核病發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選中最常選用的動物[7]。本研究采用1×105CFU結(jié)核分枝桿菌H37Rv株經(jīng)小鼠尾靜脈進(jìn)行接種，4周后即可建立穩(wěn)定的感染；8周后，小鼠肺、脾荷菌數(shù)達(dá)高峰；如未處理，可持續(xù)帶菌4周以上，并刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其應(yīng)答水平與體內(nèi)荷菌數(shù)呈正相關(guān)。經(jīng)尾靜脈注射感染的方式可使細(xì)菌通過血液在體內(nèi)傳播，但小鼠不同臟器的荷菌數(shù)分布不均勻，肺荷菌數(shù)高于脾。這可能是由于結(jié)核分枝桿菌為專性需氧菌，肺部氧含量較其他組織豐富，細(xì)菌易于定植[8]。采用異煙肼和利福平治療感染小鼠8周后，4/6小鼠肺荷菌數(shù)為零，而脾荷菌數(shù)全部為零，表明藥物治療可有效降低臟器荷菌數(shù)。同時部分小鼠肺內(nèi)仍存留細(xì)菌, 提示徹底清除肺結(jié)核分枝桿菌需更長療程。

在結(jié)核分枝桿菌感染的治療過程中，藥物作用后部分結(jié)核分枝桿菌會以持留菌的方式長期存于體內(nèi)，形成持續(xù)感染，這可能是機(jī)體免疫應(yīng)答不能有效清除此類細(xì)菌所致。因此，通過提高機(jī)體免疫應(yīng)答強(qiáng)度或改變其特征，有望加速體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的清除[9]。目前關(guān)于提高機(jī)體免疫應(yīng)答以清除體內(nèi)持留菌的研究多集中于免疫優(yōu)勢抗原，提高Th1型免疫反應(yīng)[10]。本研究觀察到，感染12周時小鼠血清中產(chǎn)生的抗結(jié)核分枝桿菌特異性IgG抗體以IgG1和IgG2a為主，但治療組與感染組相比，IgG1水平較低而IgG2a較高，因此治療組IgG2a/IgG1比值顯著高于感染組。抗體亞類的變化預(yù)示體內(nèi)免疫應(yīng)答類型的改變，感染后特異性IgG1和IgG2a亞類水平升高，但I(xiàn)gG2b和IgG3亞類幾乎沒有變化，這是小鼠在結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體體液免疫應(yīng)答的特征[11]。用異煙肼和利福平治療后，小鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌特異性IgG抗體水平降低，這與觀察到的小鼠體內(nèi)臟器荷菌數(shù)降低一致，可見小鼠體內(nèi)感染結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量與刺激產(chǎn)生的IgG抗體水平呈正相關(guān)。

結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，一般認(rèn)為其在體內(nèi)的清除依賴有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答[12]。本研究顯示，結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的脾淋巴細(xì)胞再次接觸結(jié)核分枝桿菌抗原時，表達(dá)IFN-γ和IL-2的CD4+淋巴細(xì)胞比例大量增加，呈現(xiàn)典型的Th1型免疫特征，而Th1型免疫反應(yīng)有助于細(xì)菌清除[13]，這也可能是感染一定時間后臟器荷菌量保持恒定不再升高的原因。與對照組相比，感染組CD4+脾淋巴細(xì)胞中Th2型細(xì)胞因子IL-4分泌細(xì)胞下降，可能是感染程度減輕后機(jī)體Th1/Th2免疫平衡伴隨改變的結(jié)果。藥物治療后，感染組CD4+脾淋巴細(xì)胞中表達(dá)IFN-γ和IL-2的細(xì)胞比例顯著下降，與小鼠臟器荷菌數(shù)下降趨勢一致，提示表達(dá)IFN-γ和IL-2的細(xì)胞數(shù)量與體內(nèi)荷菌數(shù)及感染程度存在相關(guān)性；而感染組和治療組小鼠IL-4表達(dá)細(xì)胞的比例均下降，且兩組間無差異，提示IL-4表達(dá)細(xì)胞數(shù)量可能與小鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染嚴(yán)重程度并不直接相關(guān)。

宿主的免疫應(yīng)答在結(jié)核病的發(fā)病和發(fā)展過程中起著極其重要和復(fù)雜的作用：一方面可清除體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，控制疾病的發(fā)展；另一方面又會產(chǎn)生相應(yīng)的免疫病理反應(yīng)，引起機(jī)體組織臟器損傷[14]。另外，有研究表明特定的免疫環(huán)境也是造成結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)變?yōu)槌至艟闹匾騕15]。因此，如何調(diào)節(jié)感染機(jī)體免疫狀態(tài)、增強(qiáng)免疫清除效果、盡可能避免免疫病理損傷是結(jié)核病免疫療法的關(guān)鍵。本研究建立的結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染小鼠模型在結(jié)核病疫苗和治療藥物的研發(fā)及篩選中具有一定的應(yīng)用價值。

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