鄧桂林，錢雪琴， 武潔，沈鑫， 張軍，盧水華，沈芳

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)是一種牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)減毒活疫苗，可有效預(yù)防播散性結(jié)核病發(fā)生，如結(jié)核性腦膜炎、粟粒型肺結(jié)核。BCG感染通常發(fā)生于免疫功能低下的接種人群，如慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease，CGD)患者、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)患者和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus，HIV)感染者，其發(fā)病率為0.1/100萬～4.3/100萬，病死率為50%～71%[1-3]?？菇Y(jié)核一線藥物為利福平、異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺，而BCG對(duì)吡嗪酰胺天然耐藥[2]，對(duì)異煙肼的敏感度亦有所減低[4]，應(yīng)用一線藥物治療可能導(dǎo)致病情延誤、加重，甚至死亡。因此，區(qū)分BCG感染與結(jié)核分枝桿菌感染對(duì)治療及預(yù)后很重要。國內(nèi)關(guān)于BCG感染已有多篇報(bào)道，但大多根據(jù)預(yù)防接種史及臨床表現(xiàn)作出分析，較少應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒別。本研究對(duì)73例0～3歲淋巴結(jié)核患兒的淋巴結(jié)穿刺液陽性培養(yǎng)物進(jìn)行菌型鑒定及多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)，以了解嬰幼兒淋巴結(jié)核的主要病原體及其分子生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源H37Rv、牛分枝桿菌和BCG由上海市疾病預(yù)防控制中心提供；79株臨床分離株來自上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心的73例0～3歲淋巴結(jié)核患兒淋巴結(jié)穿刺液標(biāo)本(男53例、女20例)，其中5例患兒存在重復(fù)菌株(男4例有5株重復(fù)，女1例有1株重復(fù))。

1.1.2主要儀器及試劑所用儀器及試劑包括基因擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、分析軟件Quantity One (Bio-Rad公司)、試劑盒Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、試劑盒2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1化學(xué)法取新鮮培養(yǎng)物(2～3周)，以含0.5% 吐溫80的生理鹽水配制成10-2mg/ml的懸液，用10 μl標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)接種1支對(duì)硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培養(yǎng)基、1支噻吩-2-羧酸肼(thiophene-2-carboxylic acid hydrazide，TCH)培養(yǎng)基和2支改良L-J培養(yǎng)基。接種后1支L-J培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)，PNB培養(yǎng)基、TCH培養(yǎng)基和另1支L-J培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4周，觀察各培養(yǎng)基上菌落生長情況。37 ℃ L-J培養(yǎng)基菌落生長良好，則繼續(xù)觀察28 ℃ L-J培養(yǎng)基、37 ℃ PNB培養(yǎng)基、37 ℃ TCH培養(yǎng)基的生長情況。28 ℃L-J培養(yǎng)基和(或)37 ℃ PNB培養(yǎng)基上有菌落生長判為非結(jié)核分枝桿菌；28 ℃L-J培養(yǎng)基和37 ℃ PNB培養(yǎng)基上無菌落生長判為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。37 ℃ TCH培養(yǎng)基上有菌落生長為人型結(jié)核分枝桿菌；37 ℃ TCH培養(yǎng)基上無菌落生長考慮為牛分枝桿菌。若37 ℃L-J培養(yǎng)基菌落生長不良，則繼續(xù)放置至8周觀察，結(jié)果判斷亦同。具體操作參見《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]。

1.2.2核酸提取雙蒸水制備菌懸液，80 ℃滅活30 min，100 ℃水浴10 min，立即置冰上2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3分子生物學(xué)鑒定根據(jù)Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)果判讀。

1.2.4結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定根據(jù)Parsons等[6]的設(shè)計(jì)進(jìn)行引物合成和結(jié)果判斷，生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。具體序列見表1。擴(kuò)增片段包括RD1、 RD9和RD10。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μl，其中含上、中、下引物(10 pmol/L)各0.4 μl，2×Taq PCR MasterMix 10 μl，模板1 μl，雙蒸水補(bǔ)至反應(yīng)體積。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 10 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；后延伸72 ℃ 7 min。取3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，以50 bp DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，于1%瓊脂糖凝膠12.5 V/cm電泳40 min，用凝膠成像儀掃描成像。

表1 缺失區(qū)擴(kuò)增用引物序列Tab.1 Primer sequences for deleted region analysis

1.2.5MLVA分型根據(jù)Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)果判讀，位點(diǎn)包括QUB-11b、QUB-18、QUB-26、QUB-4156、QUB-1895、MIRU26、MIRU31、MIRU10、MIRU40、Mtub21、Mtub04和ETR-F。結(jié)果輸入http: //www.miru-vntrplus.org進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌鑒定

傳統(tǒng)化學(xué)法培養(yǎng)4周，79株菌株在37 ℃ L-J培養(yǎng)基菌落生長均良好，在37 ℃ PNB和28 ℃ L-J培養(yǎng)基上均無菌落生長；3株在37 ℃ TCH培養(yǎng)基上可見明顯菌落生長。據(jù)此判斷79株菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其中76株可能為牛分枝桿菌，3株為人型結(jié)核分枝桿菌。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，79株菌株中有3株存在850 bp和361 bp產(chǎn)物，76株僅存在850 bp產(chǎn)物，所有菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無雜帶干擾。根據(jù)試劑盒操作說明書，79株菌株均判為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其中3株為人型結(jié)核分枝桿菌。

2.2 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定

RD1、RD9和RD10擴(kuò)增產(chǎn)物顯示，H37Rv和3株臨床分離株RD1、RD9和RD10均存在(圖1)；牛分枝桿菌存在RD1，缺失RD9、RD10；BCG和76株臨床分離株RD1、RD9和RD10均缺失。由此可見，79株菌株中，76株為BCG菌株，3株為人型結(jié)核分枝桿菌。76株BCG分別來自70例患兒，占95.9%(70/73)；人型結(jié)核分枝桿菌則占4.1%(3/73)。

2.3 MLVA分型

人型結(jié)核分枝桿菌與BCG間存在多態(tài)性差異(圖2)。經(jīng)12位點(diǎn)分析，獲得4個(gè)基因型(表2)。其中3株為獨(dú)立基因型；76株成簇，結(jié)合2.2結(jié)果顯示為BCG菌株，即為同一來源。3株獨(dú)立基因型菌株經(jīng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定為人型結(jié)核分枝桿菌。4個(gè)基因型與數(shù)據(jù)庫菌株比較，BCG菌株與牛分枝桿菌具有親源性，3株人型結(jié)核分枝桿菌則屬結(jié)核分枝桿菌北京基因型(圖3)。

A: RD1. B: RD9. C: RD10.M, 50 bp DNA marker; Rv, H37Rv; MB, Mycobacterium bovis; Lanes 1-11, isolates.

M, 50 bp marker; Lanes 1-10, isolates; Rv, quality control H37Rv. Rv and lane 7 showed 5 alleles (422 bp), lane 6 showed 6 alleles (491 bp) and other lanes showed 3 alleles (284 bp).

圖3 4個(gè)基因型的輻射進(jìn)化樹Fig.3 Radial neighbor-joining tree of four genotypes (including reference strains in tree)

表2 MLVA基因型及重復(fù)序列數(shù)Tab.2 Genotypes and numbers of MLVA

3 討論

BCG是一種牛分枝桿菌經(jīng)236代人工培養(yǎng)形成的減毒活疫苗，主要用于結(jié)核病預(yù)防，也可用于膀胱癌治療。因其為減毒活疫苗，當(dāng)免疫力低下人群接種BCG時(shí)，有可能導(dǎo)致感染。有文獻(xiàn)報(bào)道，某些疾病的治療亦可引起B(yǎng)CG感染[7-9]。診斷時(shí)，傳統(tǒng)化學(xué)方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長，且難以區(qū)分牛分枝桿菌與BCG[10]。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的廣泛開展，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與牛分枝桿菌相比，BCG存在RD1缺失；與人型結(jié)核分枝桿菌相比，BCG存在RD1、RD9和RD10缺失。本研究對(duì)來自73例淋巴結(jié)核患兒的79株臨床分離株進(jìn)行以上片段擴(kuò)增，結(jié)果顯示多數(shù)為BCG感染，少數(shù)為人型結(jié)核分枝桿菌感染。結(jié)果提示，BCG是多數(shù)嬰幼兒淋巴結(jié)核的病原體。

BCG對(duì)吡嗪酰胺天然耐藥[2]，對(duì)異煙肼的敏感度逐漸降低[4]。當(dāng)異煙肼最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)升高時(shí)，藥物劑量也應(yīng)升高，從而達(dá)到有效殺菌目的。若只使用常規(guī)劑量，僅能抑制BCG生長而無法獲得有效殺滅。應(yīng)用利福平聯(lián)合異煙肼進(jìn)行常規(guī)劑量治療，可能誘發(fā)BCG多重耐藥[11]。本研究結(jié)果表明，與人型結(jié)核分枝桿菌感染相比，對(duì)BCG感染更應(yīng)采取個(gè)性化治療，以取得理想療效。

MLVA是一種以可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat, VNTR)為分子標(biāo)識(shí)基礎(chǔ)的分型方法，具有重復(fù)性好、特異度高、結(jié)果數(shù)據(jù)化、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短等特點(diǎn)?？勺償?shù)目重復(fù)序列可因結(jié)核分枝桿菌來源不同而串聯(lián)重復(fù)數(shù)不同，其側(cè)翼序列高度保守，主要用于結(jié)核分枝桿菌的流行病學(xué)調(diào)查[12]，監(jiān)測(cè)傳染病的傳染源。本研究中76株BCG的MLVA表現(xiàn)完全一致，而3株人型結(jié)核分枝桿菌無同源性，與BCG比對(duì)亦無同源性，提示該方法鑒定BCG有較高的準(zhǔn)確率。

淋巴結(jié)核的主要感染途徑[13]有以下幾條：①皮膚黏膜接種感染。感染的細(xì)菌經(jīng)淋巴管到達(dá)引流區(qū)的淋巴結(jié)而發(fā)病，此途徑的原發(fā)病灶通常為皮膚黏膜。本研究中70例BCG感染患兒通過此途徑感染。②淋巴管直接蔓延。原發(fā)病灶的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)淋巴管流入肺內(nèi)淋巴結(jié)和支氣管淋巴結(jié)，或蔓延至其他淋巴結(jié)，從而引起淋巴結(jié)核，此種感染方式原發(fā)病灶通常位于肺部。3例人型結(jié)核分枝桿菌感染患兒中，1例肺部病灶不明顯，僅局部淋巴結(jié)受累，可能通過此途徑感染。③血行播散。血行播散導(dǎo)致的淋巴結(jié)核通常為全身性多部位結(jié)核病變，淋巴結(jié)核僅為局部表現(xiàn)形式。3例人型結(jié)核分枝桿菌感染病例中，2例存在多部位感染，受累部位包括肺、淋巴結(jié)、骨、腹膜等，考慮為此途徑感染。

BCG引起嬰幼兒淋巴結(jié)核可能與3個(gè)因素相關(guān)：①患兒存在免疫狀態(tài)改變或遺傳因素改變。結(jié)核病免疫主要依靠細(xì)胞免疫，BCG亦如此，T細(xì)胞免疫缺陷可導(dǎo)致BCG易感。對(duì)于免疫功能正常的健康人群，分枝桿菌侵入機(jī)體后，CD4+輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor β，TNF-β)等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌；同時(shí)，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞分泌IL-12和IL-23，正反饋調(diào)節(jié)IFN-γ產(chǎn)生。CD8+抑制性/細(xì)胞毒性T細(xì)胞則通過溶解吞噬細(xì)菌后的巨噬細(xì)胞以清除病原體。當(dāng)患者存在IFN-γ結(jié)構(gòu)異常，或分泌異常，或調(diào)節(jié)異常，均可導(dǎo)致感染[14,15]。李惠民等[16]報(bào)道，在18例播散性BCG感染病例中，12例存在原發(fā)性免疫缺陷病，包括CGD、IL-12/IFN-γ通路缺陷、SCID等，6例存在不確定的免疫缺陷。國外亦有相似報(bào)道[17]。②BCG因素。BCG從1921年開始應(yīng)用于臨床，各個(gè)國家由于運(yùn)輸、保存及傳代用培養(yǎng)基不同，產(chǎn)生了不同亞型，而新亞型的產(chǎn)生直至1966年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)規(guī)范了疫苗的保存和轉(zhuǎn)種方法才得以阻止?，F(xiàn)用的BCG主要分為兩大類，第1類含有大量MPB70蛋白表達(dá)基因，包括2個(gè)IS6110插入序列及可表達(dá)甲基分枝菌酸和MPB64蛋白的基因，其代表亞型有BCG Tokyo、 BCG Moreau、BCG Russia和BCG Sweden。第2類僅含有少量MPB70蛋白表達(dá)基因，包括單個(gè)IS6110插入序列及無表達(dá)甲基分枝菌酸和MPB64蛋白的基因，代表亞型有BCG Pasteur、BCG Copenhagen、BCG Glaxo和BCG Tice。我國所用的BCG為1947年突變生成的亞型，屬第2類[18]。其與Calmette-Guérin最初研制的BCG相比，存在RD2缺失、IS6110_phoP缺失及串聯(lián)重復(fù)改變。Pan等[19]對(duì)4種BCG進(jìn)行全基因組測(cè)序，顯示4種疫苗亦存在基因和單核苷酸多態(tài)性不同。RD2包含多個(gè)基因，該區(qū)域基因的Rv1979c至Rv1982缺失會(huì)引起免疫反應(yīng)下降[20]，Rv1985c至Rv1986缺失則無改變。③衛(wèi)生防疫工作人員因素。衛(wèi)生防疫工作人員未嚴(yán)格掌握BCG接種禁忌證[21]，如給接受免疫抑制劑治療的患兒接種BCG，操作不規(guī)范，使用前未完全混合而使接種濃度過高、接種量超標(biāo)或注射過深(注入皮下或肌內(nèi))[22]。

本研究不足之處在于患兒來自全國不同省市，接種的BCG制品來自不同生產(chǎn)廠家，故未能收集相應(yīng)的BCG樣品，缺乏MLVA分析結(jié)果。

綜上所述，BCG是引起嬰幼兒淋巴結(jié)核的主要病原體，臨床分離的BCG其MLVA分型無差異。

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