丁海榕，林樹柱，盧錦標(biāo)，鄧海清，王國治，秦川，占玲俊

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021； 2. 中國食品藥品檢定研究院結(jié)核疫苗室，北京 100050； 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，溫州 325035

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病，死亡率僅次于艾滋病。全球每天約有3 835人死于結(jié)核病，導(dǎo)致1 000萬兒童成為孤兒。中國是全球5個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)之一，2010年15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，涂陽肺結(jié)核患病率為66/10萬[1]。全球每年結(jié)核分枝桿菌感染20億人，治療花費(fèi)上千億美元。隨著多重耐藥及廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，結(jié)核病的治療費(fèi)用增加了200倍[2]。

防控耐藥結(jié)核病的主要方法是研發(fā)新的抗結(jié)核藥物和預(yù)防性疫苗，這些藥物和疫苗的評(píng)價(jià)要借助耐藥結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型，而建立模型需實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化的耐藥毒株。目前模型所用菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv，缺乏相應(yīng)的耐藥株，因此需篩選出耐藥表型清楚、基因背景清楚、毒力較強(qiáng)且具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)耐藥毒株。建立不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡哪Ｐ托璨煌退幈硇偷木?，這就要篩選出不同耐藥表型的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化耐藥毒株。

異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampin，REP)是治療結(jié)核病的重要一線藥物[3]，但目前耐利福平菌株增多已成為全球性問題，有學(xué)者提議將結(jié)核分枝桿菌耐利福平作為其多重耐藥的標(biāo)志[4]。我國約90%耐利福平分離株同時(shí)合并耐異煙肼，特別是在復(fù)治結(jié)核病患者中。2010年全國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示[1]，復(fù)治結(jié)核病患者耐藥率前3位分別為：異煙肼(30.8%)、利福平(17.9%)、鏈霉素(streptomycin，Strep)(12.8%)。

通常耐藥結(jié)核分枝桿菌的毒力會(huì)相對(duì)下降，即細(xì)菌耐藥性的獲得常以適應(yīng)性降低為代價(jià)[5]。利福平耐藥基因rpoB常以531、526位突變?yōu)橹?，有?shù)據(jù)表明，rpoB某些突變可補(bǔ)償細(xì)菌耐藥引起的適應(yīng)性降低[6]。也有實(shí)驗(yàn)表明，katG基因 315位發(fā)生突變的耐異煙肼臨床分離株在小鼠模型中仍保留毒力[7]，即結(jié)核分枝桿菌耐藥適應(yīng)性不一定下降。由此可見，耐藥株的毒力變異較復(fù)雜，相同耐藥表型的菌株毒力也存在較大差異。因此，需通過實(shí)驗(yàn)來確定耐藥菌株的毒力，篩選出毒力合適、背景清楚的菌株作為耐藥模型用菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用菌株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國食品藥品檢定研究院提供，菌號(hào)93009。菌株經(jīng)小鼠體內(nèi)2次增毒后，接種于羅氏斜面培養(yǎng)基(BD公司)，3周后收獲菌落，經(jīng)5 μm 無菌濾器(Millipore公司)過濾制備單細(xì)胞菌懸液，分裝后凍存于-80 ℃低溫冰箱備用。取1份分裝菌液接種于羅氏培養(yǎng)基，3周后計(jì)數(shù)，確定單細(xì)胞懸液菌密度為1×107CFU/ml。

98株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由中國疾病預(yù)防控制中心收集，來自北京、山東、廣東等地區(qū)結(jié)核病患者的痰標(biāo)本，經(jīng)分離培養(yǎng)后收集。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的C57BL/6小鼠為雌性，6～8周齡，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)ILAC-PC-2013-001)，于感染前1周進(jìn)入生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1比例法藥敏試驗(yàn)按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》，用比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[8]。藥物有異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、卡那霉素(kanamycin，Km)、阿米卡星(amikacin，Am)、氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)、卷曲霉素(capreomycin，Cm)。羅氏培養(yǎng)基中藥物終濃度為異煙肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml，鏈霉素4 μg/ml L、乙胺丁醇2 μg/ml、卡那霉素30 μg/ml、阿米卡星30 μg/ml、氧氟沙星3 μg/ml L、卷曲霉素40 μg/ml。將1 mg/ml菌懸液用滅菌生理鹽水稀釋至10-3mg/ml和10-5mg/ml，吸取0.1 ml分別均勻接種于含藥培養(yǎng)基和無藥對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，最終接種菌量為10-4mg/ml和10-6mg/ml 。37 ℃孵育4周后觀察，計(jì)算耐藥百分比：耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)×100%。百分比≤1%為敏感，>1%為耐藥。

1.2.2動(dòng)物的感染與分組先將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、臨床耐藥菌株和敏感株接種于羅氏培養(yǎng)基，感染動(dòng)物前收獲斜面上生長(zhǎng)3周的細(xì)菌菌落，加入生理鹽水，用無菌玻璃研磨器研磨，與比濁管比對(duì)，將菌液密度調(diào)至1×108CFU/ml。將小鼠固定于小鼠固定器上，75%乙醇擦拭消毒尾部，對(duì)照組靜脈注射250 μl結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌液，理論感染劑量為2.5×107CFU。實(shí)驗(yàn)組靜脈注射250 μl耐藥菌菌液，理論感染劑量為2.5×107CFU。剩余菌液接種于羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周后計(jì)數(shù)，菌液密度為(1.0±0.2)×108CFU /ml，則感染劑量為(2.5±0.5)×107CFU。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每株菌感染10只小鼠，感染后每天觀察，以監(jiān)測(cè)半數(shù)死亡時(shí)間。

1.2.3DNA提取取32株菌株的滅活菌液，與DNA提取液〔10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、1% Triton X-100〕或TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L EDTA)按體積比1∶1混勻(例如：100 μl滅活菌液加到100 μl DNA提取液中)，蓋緊管蓋，100 ℃加熱20 min，13 200 r/min離心10 min，取上清液作為模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4引物設(shè)計(jì)rpoB(基因編號(hào)888164)和katG(基因編號(hào)885638)引物用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物Tab.1 Oligonucleotide sequences for primers used in PCR assays and DNA sequences analysis

1.2.5聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系為40 μl：10×PCR緩沖液5 μl、dNTP 5 μl、引物各3 μl、Taq酶0.4 μl、模板DNA 10 μl、MgCl23 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，退火1 min，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min。退火溫度見表1。

1.2.6PCR產(chǎn)物檢測(cè)取8 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外透射分析儀上判讀結(jié)果。若擴(kuò)增產(chǎn)物為目的條帶，將剩余PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

98株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株經(jīng)3次比例法藥敏試驗(yàn)，3次藥敏結(jié)果一致的有60株。然后篩選出藥物敏感譜清晰(即對(duì)二線藥物敏感，對(duì)利福平和異煙肼耐藥或敏感)的40株，其中35株的半數(shù)死亡時(shí)間≤H37Rv的半數(shù)死亡時(shí)間(35株隨機(jī)編流水號(hào))。35株中，18株對(duì)利福平合并異煙肼耐藥、5株單耐利福平，7株單耐異煙肼、5株對(duì)利福平和異煙肼均敏感(表2)。

2.2 耐藥基因rpoB 測(cè)序結(jié)果

23株耐利福平菌株中，9株rpoB基因發(fā)生TCG531TTG突變，10株rpoB基因發(fā)生CAC526GAC突變，1株rpoB基因發(fā)生TCG531TTT突變，1株rpoB未發(fā)生突變，其余2株rpoB基因可見 516、511、497位突變。合并耐異煙肼的18株中，8株rpoB基因發(fā)生TCG531TTG突變，7株rpoB基因發(fā)生CAC526GAC突變，1株rpoB基因發(fā)生TCG531TTT突變，其余2株rpoB基因可見 516、511、497位突變。利福平敏感株中，除1株rpoB基因發(fā)生TCG531TTG突變，其余均未發(fā)生突變(表2)。

2.3 耐藥基因katG 測(cè)序結(jié)果

25株耐異煙肼菌株中，18株katG基因發(fā)生AGC315ACC突變，1株katG基因發(fā)生AGC315AAC突變，1株2種突變都有，1株katG基因發(fā)生GAC329GTC突變，4株沒有突變。異煙肼敏感株中，只有1株katG基因發(fā)生AGC315ACC突變。

2.4 小鼠毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、臨床耐藥株和藥物敏感株經(jīng)靜脈感染小鼠，感染劑量為(2.5±0.5)×107CFU，每株菌感染10只小鼠，以H37Rv感染為對(duì)照組。感染后每天觀察，以確定半數(shù)死亡時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的半數(shù)死亡時(shí)間為14 d。40株藥物敏感譜清晰菌株中，35株的半數(shù)死亡時(shí)間≤H37Rv的半數(shù)死亡時(shí)間；其中32株感染后30 d內(nèi)小鼠全部死亡(10只)，2株耐異煙肼合并耐利福平菌株致死數(shù)分別為8只、9只，1株單耐利福平菌株致死數(shù)為9只。23株感染后14 d內(nèi)小鼠全部死亡，其中11株耐異煙肼合并耐利福平、3株單耐利福平、6株單耐異煙肼、 3株對(duì)異煙肼和利福平均敏感。11 d ≤ 半數(shù)死亡時(shí)間≤14 d的菌株有11株，4株為利福平敏感株、7株對(duì)利福平合并異煙肼耐藥。7 d<半數(shù)死亡時(shí)間≤10 d的菌株有9株，其中2株對(duì)利福平和異煙肼均敏感、7株耐利福平(其中4株合并耐異煙肼)。半數(shù)死亡時(shí)間≤7 d的菌株有15株，其中6株對(duì)利福平敏感、9株對(duì)利福平耐藥(圖1)。

表2 耐藥菌株耐藥信息與小鼠體內(nèi)毒力結(jié)果Tab.2 Drug-resistant strains’ information and virulence in mice in vivo

2.5 動(dòng)物模型感染菌株的確定

綜合藥敏、基因測(cè)序及小鼠毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)利福平和異煙肼均耐藥、半數(shù)死亡時(shí)間≤7 d的23號(hào)菌株(katG315位突變，rpoB526位突變)；單耐利福平、半數(shù)死亡時(shí)間≤7 d的5號(hào)菌株(katG未突變，rpoB526位突變)；單耐異煙肼、半數(shù)死亡時(shí)間≤7 d的25號(hào)菌株(katG315位突變，rpoB未突變)。而H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的半數(shù)死亡時(shí)間為14 d。這些臨床強(qiáng)毒株的耐藥表型清楚，有毒力，可用于耐藥動(dòng)物模型的建立。

A: 11 d≤LT50≤14 d. B: 7 d

3 討論

在動(dòng)物模型建立中，感染用菌株的毒力是關(guān)鍵因素之一，結(jié)核分枝桿菌毒力的評(píng)價(jià)多通過體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)適應(yīng)性來間接反映，與體內(nèi)實(shí)際毒力存在偏差，而只有體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)才能直接反映毒力。Palanisamy等在豚鼠體內(nèi)通過存活率來反映臨床分離株的毒力[9]，Aguilar等在小鼠體內(nèi)也通過存活率來反映不同基因表型的臨床分離株毒力大小[10]。我國目前尚未見多菌株體內(nèi)毒力評(píng)價(jià)的報(bào)道。小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與豚鼠相比，飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)，占用空間小，因此本研究用小鼠半數(shù)死亡時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)來篩選合適毒力的耐藥株，作為耐藥結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型所用的標(biāo)準(zhǔn)毒株。本研究中小鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)通過半數(shù)死亡時(shí)間來評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)耐異煙肼、利福平菌株的毒力較強(qiáng)。

此外，結(jié)核病藥物或疫苗評(píng)價(jià)常用小鼠或豚鼠動(dòng)物模型，由于小鼠模型多以動(dòng)物半數(shù)死亡時(shí)間或30 d死亡率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，需感染菌毒力較強(qiáng)，可選擇毒力較強(qiáng)的攻擊菌。而結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠模型常用病變指數(shù)或結(jié)核分枝桿菌分離數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究周期長(zhǎng)，模型攻擊用菌如果毒力過強(qiáng)，則難以有效區(qū)分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異。因此，本研究通過對(duì)多重耐藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，篩選出了可用于建立小鼠感染模型的臨床耐藥菌株。要注意的是，本研究?jī)?nèi)容僅滿足建立動(dòng)物模型第1階段的菌株初篩，而動(dòng)物模型建立還必須進(jìn)行毒株種子批建立、感染劑量與感染間隔確定、動(dòng)物品系選擇等基礎(chǔ)研究。

研究顯示，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的毒力與耐藥基因突變有關(guān)。一般細(xì)菌耐藥基因突變會(huì)引起毒力降低，也有研究表明一些耐藥株會(huì)通過某些突變來補(bǔ)償毒力的下降[5,6]。耐利福平菌株常見突變位點(diǎn)為531、526、522，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)突變位點(diǎn)引起的耐利福平使結(jié)核分枝桿菌耐藥株的適應(yīng)成本增加，生長(zhǎng)速率減慢，毒力減弱。有數(shù)據(jù)表明，rpoB基因某些突變可補(bǔ)償細(xì)菌耐藥引起的適應(yīng)性降低[6]。Gagneux等在5株含有rpoBTCG531TTG突變的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)4株沒有出現(xiàn)適應(yīng)性的降低[11]。本研究中，多數(shù)耐異煙肼、利福平菌株的毒力并未減弱，其中18株耐利福平合并耐異煙肼菌株的毒力有較大差異。鑒于研究菌株數(shù)量較少，尚無法證實(shí)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的毒力與耐藥基因突變有關(guān)。

本研究以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株為對(duì)照，評(píng)價(jià)了結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐藥與敏感菌株的毒力，篩選出可用于建立小鼠結(jié)核分枝桿菌感染模型的菌株。在后續(xù)感染動(dòng)物模型的建立中，有待進(jìn)一步摸索合適的菌株攻擊劑量及標(biāo)準(zhǔn)化感染的流程。鑒于我國目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范的耐藥結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型，本研究對(duì)國內(nèi)同行可提供一定的理論參考。

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