李良峰，賁銀銀，李亮助，張曉燕,2

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

據(jù)聯(lián)合國人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征計(jì)劃〔Joint United Nations Programme on human immunodeficiency virus(HIV)/acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)，UNAIDS〕的相關(guān)報(bào)道，截止2012年，全球共有3 530萬例艾滋病患者。其中2012年新發(fā)HIV感染230萬例，與2001年(340萬例)相比，降低33%[1]。目前，性傳播途徑已成為HIV最主要的傳播途徑。在中國，HIV同性之間的傳播比例越來越高。2007年HIV感染者中，同性之間傳播比例為13%，比2006年的2.5%大幅度提高[2]。近年來，殺微生物劑的研究正從無特異性作用機(jī)制的廣譜殺微生物劑慢慢向能特異性抑制HIV感染的殺微生物劑轉(zhuǎn)變，如反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(reverse transcriptase inhibitor，RTI)[3,4]。最新臨床研究表明，包含1%核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑替諾福韋(tenofovir，TFV)的凝膠制劑經(jīng)生殖道局部使用能很好地阻止HIV通過性途徑傳播[5]。馬納維諾(maraviroc，MRV)為趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)拮抗劑，通過屏蔽輔助受體CCR5來阻止HIV進(jìn)入宿主CD4+T細(xì)胞[6,7]。馬納維諾作為口服藥物在臨床試驗(yàn)中取得了較好效果，如在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，相對于安慰劑組，聯(lián)合使用馬納維諾能顯著增加CD4+細(xì)胞數(shù)量(P<0.001)，同時(shí)還能顯著改善機(jī)體的免疫應(yīng)答[8-10]。因此，馬納維諾作為候選殺微生物劑其有效性與安全性值得探索。羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose，HEC)廣泛應(yīng)用于生殖道制劑中，是一種較好的凝膠制劑載體[11]。本研究將馬納維諾溶于HEC中，在體外對其生物學(xué)活性進(jìn)行評價(jià)，為其作為殺微生物劑使用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬納維諾購自上海百誼生物科技有限公司，HEC購自美國Sigma公司，DMEM/High glucose培養(yǎng)基和改良RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Thermo公司，新生牛血清購自美國Thermo公司，噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT)試劑盒購自美國Sigma公司，熒光素酶底物購自美國Promega公司。TZM-bl、Jurkat-T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 儀器

Synergy 2多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，Victor 3多功能酶標(biāo)儀購自德國PerkinElmer公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的安全性評價(jià)

采用TZM-bl和Jurkat-T細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)中馬納維諾濃度為100 mmol/L、10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L。分為兩大組：一組馬納維諾溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，一組溶于0.015% HEC中。將細(xì)胞按1×104個(gè)/孔在96孔板中鋪板，第2天將培養(yǎng)基換成含對應(yīng)濃度馬納維諾的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；加入20 μl 15 mg/ml MTT，37 ℃、5%CO2孵育3～4 h；吸去上清液，加入200 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，在振蕩器上振蕩10 min，于490 nm處讀取光密度(optical density，OD)值。最終結(jié)果用細(xì)胞存活率來表示：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-本底OD值)/(空白對照孔OD值-本底OD值)×100%。與此同時(shí)，將各藥物濃度組、陰性對照組(不加藥物)的OD值及各藥物濃度組相對于陰性對照組被抑制的OD值輸入SPSS軟件，進(jìn)行回歸分析，選取細(xì)胞存活抑制率為10%和50%時(shí)的藥物濃度，即各種細(xì)胞90%存活和50%存活時(shí)的藥物安全濃度。

1.4 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的抗病毒活性檢測

采用96孔板，每孔加入1×104個(gè)TZM-bl細(xì)胞、100半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)的B亞型和C亞型假病毒、對應(yīng)濃度的馬納維諾和馬納維諾+HEC復(fù)合物，其中HEC最終濃度為0.015%，馬納維諾的濃度從25 nmol/L開始5倍梯度稀釋，直至0.04 nmol/L。同時(shí)設(shè)只加假病毒的陽性對照和只有細(xì)胞的陰性對照，每孔中的體系為200 μl，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。37 ℃、5% CO2孵育48 h；吸去上清液，加入25 μl細(xì)胞裂解液，振蕩器振蕩10 min；加入50 μl熒光素酶底物液，在多功能酶標(biāo)儀上讀數(shù)，用SPSS軟件計(jì)算對應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.5 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性檢測

將馬納維諾溶于1.5% HEC中，終濃度為6 mmol/L，儲存于4 ℃、室溫、30 ℃和40 ℃，保持相對濕度為75%。儲存前先檢測復(fù)合物的抗病毒活性，然后每隔1周檢測1次，持續(xù)8周。檢測時(shí)將馬納維諾稀釋至8 nmol/L(馬納維諾對C亞型假病毒的IC90)進(jìn)行抗病毒活性檢測，采用C亞型假病毒，檢測步驟見1.4。

2 結(jié)果

2.1 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的安全性評價(jià)

如圖1所示，當(dāng)馬納維諾濃度為100 mmol/L時(shí)，不管是溶于PBS還是HEC中，TZM-bl和Jurkat-T細(xì)胞幾乎100%死亡；隨著濃度不斷降低，細(xì)胞存活率越來越高；當(dāng)濃度降至10 μmol/L時(shí)，兩種細(xì)胞的存活率接近100%。用SPSS軟件可獲得馬納維諾在PBS和HEC溶液中的IC50和IC90。對于Jurkat-T細(xì)胞，馬納維諾的IC50分別為77 μmol/L(PBS)和75 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分別為2 μmol/L(PBS)和2 μmol/L(HEC)(P>0.05)；而對于TZM-bl細(xì)胞系，馬納維諾的IC50分別為205 μmol/L(PBS)和201 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分別為17 μmol/L(PBS)和16 μmol/L(HEC)(P>0.05)。由此可見，HEC的加入并不影響馬納維諾的細(xì)胞毒性，對細(xì)胞安全性沒有明顯影響。

A: TZM-bl. B: Jurkat-T.

2.2 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的抗病毒活性檢測

采用B亞型和C亞型兩種HIV假病毒來進(jìn)行體外抗病毒活性檢測。將馬納維諾分別溶于PBS和HEC中，從25 nmol/L起5倍梯度稀釋至0.04 nmol/L。結(jié)果顯示，當(dāng)馬納維諾濃度為25 nmol/L時(shí)，不管是溶于PBS還是HEC，都幾乎100%抑制病毒感染；隨著濃度不斷降低，抑制率也不斷降低；降至0.04 nmol/L時(shí)，對假病毒感染幾乎無抑制效果(圖2)。對B亞型和C亞型假病毒，馬納維諾的IC50分別為1.383 nmol/L、1.799 nmol/L(PBS)，以及0.967 nmol/L、1.264 nmol/L(HEC)。結(jié)果提示，當(dāng)馬納維諾與HEC復(fù)合使用時(shí)，HEC不但不抑制馬納維諾的抗病毒效果，反而有輕微增強(qiáng)作用。

A: B subtype. B: C subtype.

2.3 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性檢測

將馬納維諾溶于PBS和HEC后，分別置4 ℃、室溫、30 ℃和40 ℃，每隔1周進(jìn)行抗病毒活性檢測。如表1所示，保存前其對C亞型假病毒的抗病毒效果均在90%以上；在開始階段，抗病毒效果一直維持在90%左右；到第8周，其抗病毒效果仍處于90%以上。結(jié)果提示，馬納維諾不管是保存在PBS還是HEC中，都具有較好的穩(wěn)定性。馬納維諾在HEC中長期保存對其抗病毒活性無明顯影響。

表1 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性評價(jià)Tab.1 Stability evaluation of combination of maraviroc and hydroxyethyl cellulose

3 討論

HIV-1融合抑制劑在HIV-1生命周期初始階段發(fā)揮作用，是較理想的候選殺微生物劑[12,13]。其在生殖道局部使用可很好地阻止HIV-1與靶細(xì)胞結(jié)合，從而抑制病毒感染[14,15]。本研究將馬納維諾與HEC混合，形成馬納維諾凝膠制劑，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行相關(guān)評價(jià)。結(jié)果顯示，馬納維諾凝膠對B亞型和C亞型假病毒具有較好抑制效果，且HEC不但沒有抑制馬納維諾的抗病毒活性，反而在一定程度上使其活性稍微增強(qiáng)，同時(shí)沒有加劇其細(xì)胞毒性。此外，馬納維諾凝膠的抗病毒活性具有很好的穩(wěn)定性，即使在高于人體正常體溫的40 ℃，持續(xù)8周，抗病毒活性也沒有明顯降低，說明該凝膠可在人體內(nèi)長時(shí)間停留，并保持較高的抗病毒活性。這些結(jié)果提示馬納維諾凝膠有可能作為殺微生物劑來抑制HIV傳播，同時(shí)也為動物水平的評價(jià)及臨床試驗(yàn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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